小鼠肺间质纤维化中巨噬细胞亚型诱导Th17细胞分化及CD147在其中的作用

摘要

背景：
　　肺间质纤维化是一种慢性的、渐进的肺间质疾病,其特点是大量积累细胞外基质,重塑肺结构,并伴随着严重的关节炎等并发症。它是由多种原因引起的肺间质的炎症性疾病,病变主要累及肺间质,也可累及肺泡上皮细胞及肺血管。肺间质纤维化中一部分患者继发于系统性硬化症、类风湿关节炎、多肌炎/皮肌炎、系统性红斑狼疮、强直性脊柱炎及混合结缔组织病,临床上也很常见。大部分患肺纤维化的病人将会在3-8年内死于呼吸衰竭。尽管肺间质纤维化的患者死亡率很高,但是目前还没有治疗该疾病的有效方法,此病的发病机制及发展进程也不清楚。因此,加深对肺间质纤维化机制,尤其是对其病程早期阶段的认识,是该病发病机制和治疗研究亟待解决的问题。
　　辅助性T细胞17(Th17)是一种能够分泌白介素17(IL-17)的T细胞亚群,在机体防御反应和自身免疫性疾病中具有重要的意义。它是由Th0细胞在TGF-β、IL-1β、IL-6和IL-23的刺激下分化而成的辅助性T细胞,主要分泌IL-17、IL-22等促炎症因子,RORγ是其重要的转入因子。Th17细胞在多种免疫相关疾病的发病机制中起非常重要的作用,如银屑病、类风湿性关节炎、多发性硬化、炎性肠病和支气管哮喘,近几年来发现Th17细胞在肺间质纤维化中也有非常重要的作用。
　　单核吞噬细胞前体经微环境中某些微生物产物和细胞因子的诱导能够发生分化,并且因诱导因素不同而表现出不同表型和功能特点。它大体可分为两种不同的亚型,即M1和M2型巨噬细胞,各亚型的功能差异很大。虽然国内外已有很多文献报道巨噬细胞能够促进Th17细胞的分化,但是各亚型对Th17细胞的分化的作用还不是很明确。
　　在肺间质纤维化中,某些细胞特别是巨噬细胞和中性粒细胞上的CD147高表达,并且CD147可能促进肺纤维化的进程。已有文献报道,CD147与细胞因子TGF-β、IL-6等也有一定关系,因此我们推断CD147与Th17的分化也是有关系的。本课题旨在将肺间质纤维化、巨噬细胞亚型、Th17细胞和CD147分子联系起来,阐明肺间质纤维化中M1、M2型巨噬细胞与Th17细胞分化之间的关系及机制,并研究清楚CD147在其中的作用。这将对炎症的研究及治疗起到一定的推动作用。
　　目的：
　　建立肺间质纤维化小鼠模型,并用HAb18G/CD147抗体治疗,观察小鼠体内巨噬细胞亚型和Th17细胞的数量变化;从肺间质纤维化小鼠的肺组织中分离M1、M2型巨噬细胞和CD4+T细胞共培养,并用HAb18G/CD147抗体封闭和慢病毒干涉CD147,观察Th17细胞的分化情况,阐明肺间质纤维化中M1、M2型巨噬细胞与Th17细胞分化之间的关系及机制,并研究清楚CD147在其中的作用。
　　方法和结果：
　　1.HAb18G/CD147抗体治疗肺间质纤维化小鼠及Th17细胞、M1、M2型巨噬细胞数量的变化
　　1.1.肺间质纤维化小鼠模型的建立及HAb18G/CD147抗体治疗
　　9~11周龄的雌性C57BL/6小鼠随机分为3组:模型组(BLM组)24只、HAb18抗体治疗组和治疗对照组,每组各6只。用气管滴注法建立肺间质纤维化小鼠模型,于造模次日起腹腔注射给药,治疗组用HAb18G/CD147抗体(10mg/kg),治疗对照组予同体积的生理盐水,每日1次。BLM组不予治疗。
　　1.2.检测及研究
　　模型组于注射博来霉素后第4d、7d、14d、28d分批取材,每次每组6只,3只用于肺组织切片,3只用于研磨提取淋巴细胞。治疗组和治疗对照组于连续给药后第14天取材。将小鼠组织块置4％多聚甲醛/0.1PBS固定24h,经脱水、石蜡包埋后,制作石蜡切片(切片厚度3μm),HE染色观察肺组织炎症改变,Masson染色观察肺组织纤维化情况。取小鼠肺组织研磨消化后,加入5mL红细胞裂解液,冰上裂解10min,然后轻轻加到5mL小鼠淋巴细胞分离液(购于Mediatech)上层,2000rmp离心20min,吸取中间层的单核、淋巴细胞,用于流式分析。提取模型组和HAb18G/CD147抗体治疗组的小鼠肺组织淋巴细胞的mRNA,进行Real-timePCR检测。
　　1.3.结果
　　1.3.1.治疗前及治疗后小鼠肺组织病理观察
　　第4d开始BLM组的肺泡间隔逐渐增宽,有少量淋巴细胞浸润,也可见少量的、散在的中性粒细胞、单核-巨噬细胞浸润;第7d,肺间隔增宽明显,炎症反应加重,有大量淋巴细胞、少量单核-巨噬细胞浸润,胶原纤维沉积增多,第14d,见肺组织结构破坏,瘢痕形成。对HAb18G/CD147抗体治疗小鼠第14d时的肺组织进行切片,HE染色和Masson染色发现HAb18G/CD147抗体治疗后,小鼠肺间质炎症明显减轻,间质内及小支气管周围胶原纤维沉积减少。BLM组与治疗对照组间相比均未见明显差异。
　　1.3.2.流式检测治疗前后M1、M2型巨噬细胞和Th17细胞的数量变化
　　流式检测注射博来霉素后第4d、7d、14d、28d的小鼠肺组织中Th17细胞、M1、M2型巨噬细胞的数量变化,发现随着小鼠肺组织病变的增加,其Th17细胞、M1、M2型巨噬细胞的数量逐渐增加,在第14天时,达到最大值,第28天时,三种细胞的数量都有下降,其中Th17细胞和M1型巨噬细胞下降的较多。
　　流式检测模型组和HAb18G/CD147抗体治疗组的小鼠肺组织中M1、M2型巨噬细胞和Th17细胞的数量变化,发现经过治疗后的小鼠,M1型巨噬细胞略有下降,2.70%±0.45%~1.97%±0.36%;M2型巨噬细胞变化不明显,4.80%±0.54%~4.94%±0.23%;Th17细胞明显下降,3.24%±0.38%~1.50%±0.54%。
　　1.3.3.Real-timePCR检测治疗前后小鼠肺组织淋巴细胞中的细胞因子
　　提取模型组和HAb18G/CD147抗体治疗组的小鼠肺组织淋巴细胞的mRNA,进行Real-timePCR,发现经过抗体治疗后的小鼠TGF-β、IL-6、IL-1β都明显下降,其中TGF-β下降将近一倍。
　　2.肺间质纤维化中M1、M2型巨噬细胞对Th17细胞的诱导作用
　　2.1.M1、M2型巨噬细胞及CD4+T细胞的分离
　　取小鼠肺组织研磨消化后,加入5mL红细胞裂解液,冰上裂解10min,然后轻轻加到5mL小鼠淋巴细胞分离液(购于Mediatech)上层,2000rmp离心20min,吸取中间层的单核、淋巴细胞,用于流式分析和分选。
　　流式分选:将收取的单核、淋巴细胞用FITC-CD16/32,PE-CD206和PerCP-CD4标记,室温放置30min,用MOFLO流式分选仪分选。
　　2.2.检测及研究
　　分选之后的M1、M2型巨噬细胞分别与CD4T细胞共培养,并加入5ug/mlanti-CD3和10ug/mlanti-CD28刺激,三天后收集CD4T细胞用于流式分析。
　　流式分析:将共培养之后的CD4T细胞分离出来,在1uM莫能菌素条件下培养4小时,然后用PE-CCR6标记胞外抗原,室温放置30min;用BDCytofix/Cytoperm和BDPerm/Washkit固定破膜,FITC-IFNγ,PE-IL-17和PerCP-RORγt标记胞内抗原,4℃放置半小时,PBS洗三遍,流式上机分析。
　　2.3.结果
　　2.3.1.M1、M2型巨噬细胞对Th17细胞分化的诱导作用
　　流式分析发现,在与M1共培养的CD4T细胞中,诱导成的CCR6、IL-17和RORγt分别是与M2共培养的CD4T细胞的~5(4.96%±0.46%to1.22%±0.21%),~3(3.87%±0.32%to1.24%±0.23%)和~4(2.54%±0.28%to0.60%±0.15%)。2.3.2CD147在M1型巨噬细胞对Th17细胞分化的诱导中的作用
　　。在M1型巨噬细胞与CD4T细胞共培养体系中,加入2ug/mlCD147/HAb18抗体封闭CD147,3天后,分离出CD4T细胞,进行CCR6染色,标记出Th17细胞。发现CCR6的表达水平在CD147/HAb18抗体封闭组中要低(1.84%±0.45%),而在未加抗体组中的表达水平要高(4.15%±0.68%)。同样的结果,将用慢病毒干涉掉CD147的M1型巨噬细胞与CD4T细胞共培养,发现CCR6的表达水平在慢病毒干涉组中要低(2.06%±0.48%),而在未干涉组中的表达水平要高(4.84%±0.72%)。
　　结论：
　　本实验发现M1型巨噬细胞对Th17细胞的分化有正向促进作用,并且CD147通过调节促Th17细胞分化的细胞因子,TGF-β、IL-6和IL-1β,促进该过程的发生。但是,Th17细胞分化是一个复杂的过程,涉及到多种不同的细胞和细胞因子,以后的实验将会对CD147促进Th17细胞分化的机制进行进一步研究。

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缩略语表

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前言

文献回顾

1. 肺间质纤维化

2. 巨噬细胞

3. Th17细胞

4. 巨噬细胞与Th17细胞的关系

5. CD147在肺间质纤维化中的作用

正文

实验一 HAb18G/CD147 抗体治疗肺间质纤维化小Th17细胞、M1、M2型巨噬细胞数量的变化

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

实验二 肺间质纤维化中M1、M2型巨噬细胞对Th17细胞的诱导

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

小结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢