外源性BMSCs在小鼠实验性骨关节炎TMJ软骨中存活、定植和分化的实验研究

摘要

骨性关节炎(osteoarthritis,OA)是一种发病率较高的关节疾病,以软骨退变和软骨下骨异常改建为主要病理表现。颞下颌关节(temporomandibularjoint,TMJ)是OA好发部位之一。骨性关节炎所造成的软骨退变,采用传统治疗方法很难自行完善修复,而骨髓间充质干细胞(bonemesenchymalstemcells,BMSCs)具有较强的自我更新能力和多向分化潜能,在特定的诱导条件下可分化为软骨细胞。本实验以本课题组所建的咬合紊乱致小鼠髁突软骨退行性变模型为研究对象,评价外源性BMSCs向病变髁突软骨迁移、定植、分化的特征。
　　实验方法与结果
　　1.实验性单侧前牙反牙合致小鼠颞下颌关节髁突骨关节炎样变动物模型的建立:
　　将第四军医大学实验动物中心提供的60只6周龄雌性C57BL6小鼠,随机、等量分为空白对照组和实验组。实验组小鼠左侧上、下前牙粘接统一规格金属不良修复体,造成左侧前牙反牙合的异常咬合接触。对照组小鼠进行对照操作,给予同样的饲养环境至实验结束。实验组和对照组在实验室开始后3w处死动物,取出双侧颞下颌关节后常规脱钙,石蜡包埋,进行HE、甲苯胺蓝染色以及形态学的测量。HE染色显示,对照组髁突软骨表面光滑连续,细胞排列整齐。实验组髁突软骨出现明显退变,表现为软骨厚度变薄,软骨细胞数目减少,细胞排列紊乱,个别出现明显的无细胞区;甲苯胺蓝染色显示的蛋白多糖表达明显低于对照组;软骨下骨的骨体积分数和骨小梁厚度明显低于对照组,骨小梁间隙高于对照组(P<0.05)。
　　2.TMJ髁突软骨诱导BMSCs向软骨细胞分化的实验研究:
　　首先,将GFP-BMSCs分为三组,两个共培养组和一个单独培养组。共培养组实验组(OATMJ)和对照组(TMJ)髁突软骨组织块放在膜孔8μm的transwell小室上层,GFP-BMSCs接种在小室的下层,分别于共培养后3、7、14、21d收集下室GFP-BMSCs。单独培养组的GFP-BMSCs于相应的时间点进行收集。用Trizol法提取两个共培养组GFP-BMSCs和单独培养组GFP-BMSCs总RNA,采用RealTimePCR定量分析COLII基因的含量。其次,分别取两个共培养组以及单独培养组的GFP-BMSCs、原代软骨细胞进行细胞爬片,行甲苯胺蓝和免疫荧光化学染色。结果显示,与髁突软骨共培养的GFP-BMSCs表达COLII,明显高于单独培养的GFP-BMSCs(P<0.05),实验组和对照组没有明显差异(P>0.05)。
　　3.TMJ髁突软骨诱导GFP-BMSCs定向迁移的离体实验研究:
　　采用膜孔径8μm的transwell小室鉴定GFP-BMSCs的迁移,取造模3w的实验组和同龄对照组髁突软骨组织块放在小室的下层,上层接种GFP标记BMSCs,24h后,对小室上层进行DAPI染色,观察从上层上面迁移到上层下面的细胞数;7d,行甲苯胺蓝染色;21d后,将transwell下室的TMJ进行常规包埋,行HE、免疫组织化学、免疫荧光化学染色。24h,DAPY染色显示,实验组迁移的细胞数量多于对照组(P<0.05);7d甲苯胺蓝染色显示,无论是实验组还是对照组,髁突软骨以及髁突软骨附近的GFP-BMSCs均呈蓝紫色,而远离髁突软骨GFP-BMSCs不着色;21dHE染色显示,实验组髁突软骨内有大量的异质性的细胞核,对照组髁突软骨中未见此现象;GFP免疫组织化学染色和免疫荧光染色均显示,实验组髁突软骨GFP表达阳性,而对照组髁突软骨未见表达GFP表达。
　　4.外源性BMSCs注射于TMJ区域后生物发光技术示踪观察:
　　采用荧光素酶慢病毒转染GFP-BMSCs,获得持续稳定表达荧光素酶的LUC-BMSCs。在造模3w的小鼠右侧TMJ区域,注射LUC-BMSCs(1x108/ml)25μl,左侧注射等量的生理盐水,在成像系统下纵向动态观察28d内信号的变化。LUC-BMSCs持续稳定表达荧光素梅,且表达量与细胞数量呈线性相关。LUC-BMSCs注射小鼠TMJ区域后,实验组小鼠颞下颌关节区域生物发光的信号强度从1.537×106P?s-1?cm-1?sr-1起持续升高,到7d时达到峰值(3.997×106P?s-1?cm-1?sr-1)之后逐渐降低,到28d时信号强度降低到1.797×104P?s-1?cm-1?sr-1。
　　5.TMJ局部注射外源性BMSCs治疗TMJOA的组织学评价:
　　取6周龄C57BL6小鼠60只,随机、等量分为空白对照组和实验组。造模3w后,每周在实验组和对照组的小鼠右侧颞颌关节区域注射浓度为1x108/ml的GFP-BMSCs25μl,左侧注射盐水25μl。分别在注射GFP-BMSCs后4w、8w、12w处死,取出双侧髁突,多聚甲醛固定,石蜡包埋,行HE、免疫组织化学染色。HE染色结果显示,相同时点,实验组注射GFP-BMSCs髁突软骨厚度明显高比注射生理盐水侧的髁突软骨厚度(P<0.05);12w,实验组注射GFP-BMSCs侧髁突软骨厚度与对照组髁突软骨无明显差异(P>0.05);免疫组化染色显示实验组髁突软骨内有GFP阳性表达,而对照组髁突软骨内未见到GFP阳性表达。
　　实验结论
　　实验性单侧前牙反牙合可以导致髁突软骨组织发生明显的退行性病理性改变,退变软骨可诱导外源性BMSCs定向迁移,并且BMSCs可以定植于退变髁突软骨内,对退变髁突软骨起明显的修复作用。

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前言

文献回顾

实验一 实验性单侧前牙反牙合导致小鼠颞下颌关节髁突骨关节炎样变小鼠模型的建立

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

实验二 TMJ髁突软骨诱导BMSCs向软骨细胞分化

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

实验三 实验组髁突软骨诱导GFP-BMSCs定向迁移的离体实验研究

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

实验四 生物发光技术示踪外源性BMSCs在实验组TMJ区域存活的实验研究

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

实验五 TMJ局部注射GFP-BMSCs对TMJ OA的治疗作用

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

小结

参考文献

附录

个人简历和研究成果

致谢