低频脉冲磁场调节NO:ONOO-对缺氧复氧条件下心肌细胞的影响

摘要

研究背景
　　急性心肌梗死(acutemyocardialinfarction,AMI)是由于冠状动脉闭塞、血流量急剧减少,导致相应心肌组织缺血缺氧,引起细胞能量代谢障碍和功能失调,救治不及时可能产生严重的心肌损伤甚至猝死。目前AMI治疗手段通常采取介入治疗或溶栓治疗尽快打开闭塞血管,恢复冠状动脉血流,挽救存活的心肌。然而,缺血/再灌注(ischemiareperfusion,I/R)和无复流(no-reflow,NR)造成的心肌损伤是缺血性心脏病治疗过程中的重要问题[1]。寻求一种积极有效地保护性治疗措施,抑制或减轻开通闭塞冠状动脉产生I/R和NR所致的心肌损伤,具有重要的临床意义。
　　磁场的生物学效应愈来愈受到人们的重视,研究发现磁场通过不同的机制可使分子细胞、组织器官甚至整个机体发生形态和功能的改变[2]。研究显示:磁场具有抗炎、抗氧化、抗血栓、促进一氧化氮(NO)生成等生理效应,并能抑制主动脉内粥样斑块的形成,还可促进缺血心肌组织的血管修复与新生[3-5],并能有效抑制I/R导致的大鼠心肌损伤,进而改善心脏功能[6-8]。然而,关于磁场对I/R引起的心肌细胞损伤保护机制机理尚不清楚。
　　因此,我们对磁场、NO、氧化应激与心肌缺血的关系进行梳理,本实验旨在观察低频脉冲磁场(LF-PMFs)对缺氧/复氧(H/R)条件下SD乳鼠心肌细胞的影响,研究一氧化氮/过氧亚硝基阴离子(NO/ONOO-)及通路在磁场对H/R条件下心肌细胞损伤中的地位与作用,并进一步探讨磁场的保护机制。
　　研究目的
　　1.观察不同参数LF-PMFs对H/R条件下乳鼠心肌细胞增殖与凋亡的影响,筛选出最佳磁场。
　　2.观测LF-PMFs对H/R的心肌细胞NO/ONOO-及其通路的影响,研究探讨磁场作用的保护机制与NO/ONOO-之间的关系。
　　实验方法
　　采用酶消化法分离SD乳鼠心肌细胞,差速贴壁法提纯心肌细胞,运用形态学和免疫组化染色法(cTnI)鉴定心肌细胞,MTT比色法测绘心肌细胞生长曲线;建立SD乳鼠心肌细胞的H/R模型,缺氧与复氧的时间分别为3h;选取磁场参数:磁场为矩形波,频率为15Hz、20Hz,磁场强度为1.5mT、3.0mT、4.5mT、6.0mT;作用时间分别为1h、3h、5h。
　　将SD乳鼠心肌细胞随机分为3组:(1)对照组(Control):常规培养心肌细胞,不做任何干预;(2)H/R组:心肌细胞进行缺氧和复氧处理;(3)磁场组:在心肌细胞缺氧前用LF-PMFs干预,观察磁场对心肌细胞损伤的预防作用,复氧后用LF-PMFs干预以观察磁场对损伤心肌细胞的治疗效果。
　　心肌细胞进行H/R和LF-PMFs干预后,用TUNEL法检测心肌细胞的凋亡程度,MTT比色法检测细胞的增殖活性,观察比较不同LF-PMFs对H/R条件下心肌细胞的影响,筛选出最佳磁场参数;然后用最佳磁场和H/R作用心肌细胞后,WST-1法和免疫组化染色法(Dihydroethidium,DHE)检测O2￣,Griess法测定NO和ONOO-,化学发光法检测NADPH氧化酶活性;免疫印迹法(WesternBlot)检测eNOS磷酸化水平。
　　实验结果
　　1.在H/R条件下,LF-PMFs可促进乳鼠心肌细胞增殖,抑制其凋亡;4.5mT、15Hz作用时间3h的磁场保护效果显著。
　　2.LF-PMFs可减少H/R损伤的心肌细胞O2￣含量:对照组(0.267±0.049μmol/L)、LF-PMFs+H/R组(0.326±0.055μmol/L)和H/R+LF-PMFs(0.324±0.056μmol/L)组O2￣生成较H/R组(0.401±0.116μmol/L)明显减少(P<0.05),提示LF-PMFs能抑制H/R乳鼠心肌细胞O2￣的生成。
　　3.LF-PMFs对H/R损伤的乳鼠心肌细胞NO及ONOO-生成的影响:H/R组(3.15±1.06μmol/L)较对照组(5.74±2.26μmol/L)和磁场组(4.52±1.95μmol/L、4.58±1.60μmol/L)NO生成明显减少(P<0.05),而H/R组(27.42±5.74μmol/L)较对照组(18.12±4.08μmol/L)和磁场组(21.67±5.45μmol/L、20.85±5.77μmol/L)ONOO-生成明显增加(P<0.05),磁场组间无明显差别(P>0.05);H/R组NO/ONOO-比值较磁场组明显降低(P<0.05),磁场组间无显著差异(P>0.05)。
　　4.化学发光法检测NADPH氧化酶活性:与H/R组比较,磁场组能显著降低H/R损伤的乳鼠心肌细胞NADPH氧化酶活性(P<0.05)。
　　5.WesternBlot检测心肌细胞eNOS磷酸化水平:磁场可增加心肌细胞eNOS磷酸化表达,对H/R损伤的乳鼠心肌细胞具有保护作用(P<0.05);磁场组间无显著差别(P>0.05)。
　　结论
　　1.H/R损伤的SD乳鼠心肌细胞经过15Hz4.5mT的矩形波LF-PMFs干预3h,显著促进心肌细胞增殖活性并抑制其凋亡程度。
　　2.磁场对H/R损伤的心肌细胞保护作用可能是通过调节NO/ONOO-平衡来实现的,其具体机制为:增强心肌细胞eNOS磷酸化表达,增加NO产量;同时又抑制NADPH氧化酶的活性,减少心肌细胞O2￣生成量,进而降低ONOO-含量,调节NO/ONOO-平衡。

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文献回顾

正文

第一部分 低频脉冲磁场对缺氧复氧条件下心肌细胞影响的研究

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

第二部分 低频脉冲磁场调节 NO/ONOO-对 H/R 心肌细胞损伤保护机制的研究

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

小结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢