P15INK4b慢病毒感染联合Bcr-abl siRNA及STI571对慢性粒细胞白血病K562细胞的实验研究

摘要

慢性粒细胞性白血病（chronic myeloid leukemia. CML）是一种起源于多能干细胞异常克隆的恶性增殖性疾病，约占白血病总发病率的15％，多见于老年人。绝大多数CML患者白血病细胞中具有费城染色体（Ph染色体），它是有9号染色体长臂3区4带和22号染色体长臂1区1带相互易位融合而成，使位于9号染色体上的c-abl1原癌基因在第二外显子的5’端断裂，与22号染色体的M-Bcr基因第2或第3外显子的3’端结合，形成Bcr-abl融合基因，该基因编码P210蛋白，具有持续而强烈的酪氨酸激酶活性，可使粒细胞发生恶性增殖。
　　基于 Bcr-abl融合基因在慢性粒细胞性白血病中的重要病理意义，诺华制药公司于2001成功开发Bcr-abl特异性抑制剂--STI571用于CML的治疗，成为第一个靶向治疗药物。STI571的应用使原来CML的5年生存率由20%提升至90%，被称为是CML治疗史上的里程碑。然而，随后8年随访研究发现约16%的患者因药效降低停止服用STI571，有6%的患者由于不良反应而停止用药。随着STI571在CML治疗中的大量应用，其耐药性的问题已愈发明显，尤其是Bcr-abl基因突变位点的增多，出现了越来越多STI571治愈无效的CML患者。因此，寻找抑制效能更强或Bcr-abl以外的新靶点是当前CML治疗研究的一项前沿课题。最近的研究表明CML的治疗需在抑制Bcr-abl的基础上，同时联合其它新发现或确认的靶点进行联合治疗，可显著提高CML的治愈率。
　　P15INK4b是细胞周期蛋白激酶抑制剂INK4家族的一员，又被称作CDKN2b和MTS2,它位于人类9号染色体，通常与P16INK4a和P14ARF一起发生改变。P16INK4a和P15INK4b都可通过抑制CDK4/6，使细胞停滞于G1期。在血液病中，P16INK4a和P15INK4b表达降低通常是由于外界原因使基因发生甲基化所导致。而且，P15INK4b是唯一在MDS和AML中发生甲基化的INK4家族成员，提示它在粒细胞疾病中的具有特异性。临床研究显示50-60%的骨髓异常增殖综合症患者和70-80%急性粒细胞性白血病患者都会发生 P15INK4b的甲基化改变，提示我们P15INK4b可能参与了白血病的病理过程。
　　P15INK4b的生物学活性研究表明它具有以下3方面的特性：1.P15INK4b在体内具有肿瘤抑制因子的作用，逆转录病毒引起的髓性单核粒细胞性白血病存在明显的P15INK4b基因5’CpG岛甲基化改变，而当P15INK4b缺失被重新构建时，粒细胞增殖情况得到显著抑制。2. P15INK4b显示可以促进造血干细胞向红细胞的分化，抑制其向粒细胞的分化。3. P15INK4b在促进树突细胞成熟中的作用，增强免疫监督作用。上述三种生物学活性均表明P15INK4b可能成为治疗CML的潜在靶点。
　　基于上述理论基础，本研究旨在观察P15INK4b与Bcr-abl抑制联合应用是否可提高CML的治疗效率。为了实现这一目的，我们首先构建了P15INK4b慢病毒表达载体，通过RT-PCR方法从人外周单个核细胞中扩增P15INK4b基因，经纯化回收后连接于PCDH-CMV-MCS-EF1-COPGFP载体上构建P15INK4b慢病毒表达载体。然后对P15INK4b基因进行慢病毒包装，制备P15INK4b的病毒颗粒感染K562细胞，使其稳定表达P15INK4b基因。其次，构建Bcr-abl siRNA，采用荧光素酶基因(基因序号 M15077,394414)作为非特异性对照,将 Bcr-abl siRNA转染 K562细胞抑制P210bcr-abl的表达。同时，结合对STI571的研究，通过排列组合的方式，观察STI571，P15INK4b慢病毒感染和Bcr-abl siRNA转染联合作用后对K562细胞增殖、细胞周期及细胞凋亡等的影响，为指导CML的治疗提供新的理论基础。
　　1. P15INK4b慢病毒载体构建及病毒滴度测定
　　P15INK4b慢病毒表达载体经慢病毒包装后，经逐孔稀释法测定病毒的滴度为2×108U/ml。P15INK4b慢病毒感染可显著抑制K562细胞增殖，阻滞细胞周期，诱导细胞凋亡。
　　2.Bcr-abl特异性siRNA可显著抑制K562细胞增殖，使细胞阻滞于G0/G1期，且具有明显的诱导凋亡的作用；
　　本研究发现Bcr-abl siRNA转染可显著抑制K562细胞内P210bcr-abl蛋白的表达，转染48h时，抑制率约为85%。细胞增殖实验显示，Bcr-abl siRNA转染可在24-96h内显著抑制K562细胞的增殖，在48h时，可显著阻滞细胞周期，使处于G1期的细胞比例明显增加，并且可诱导细胞凋亡的出现。
　　3.P15INK4b慢病毒感染联合Bcr-bal siRNA或STI571对K562细胞增殖抑制作用明显加强
　　细胞增殖实验表明，P15INK4b慢病毒感染，Bcr-abl siRNA转染或STI571单独应用均可显著抑制K562细胞的增殖率，且呈现明显的时间依赖性。P15INK4b慢病毒感染+Bcr-abl抑制抑制效率显著高于两者单独应用；P15INK4b感染+STI571抑制效率显著高于两者单独应用，Bcr-abl抑制+STI571抑制抑制效率显著高于两者单独应用，上述结果提示我们P15INK4b慢病毒感染联合Bcr-abl抑制可显著提升对K562细胞增殖的抑制率。
　　4.P15INK4b慢病毒感染联合Bcr-bal siRNA或STI571对K562细胞周期的影响
　　流式细胞术检测结果显示，P15INK4b慢病毒感染可显著提高G1期细胞比率，降低S期细胞比率，表明P15INK4b表达可延缓DNA复制。P15INK4b表达与Bcr-abl抑制或STI571联合应用可显著增加处于G1期的细胞比率，提示P15INK4b与Bcr-abl抑制或STI571联合应用可显著抑制DNA的复制，降低细胞增殖速率。机制分析显示与单独治疗组相比，联合治疗组可显著抑制Cyclin D1和CDK4的表达，上述结果提示我们，联合治疗可显著抑制细胞周期依赖蛋白或激酶的表达，从而发挥阻滞细胞周期的作用。
　　5. P15INK4b联合Bcr-bal siRNA或STI571对K562凋亡的影响
　　流式细胞术检测结果显示，与空载体组相比，P15INK4b慢病毒感染可显著提高细胞凋亡率，表现为Annexin-V阳性细胞比率的增加。Bcr-abl siRNA转染和STI571亦有相似的作用。P15INK4b与Bcr-abl抑制或STI571联合应用可显著增加细胞凋亡率，提示P15INK4b与Bcr-abl抑制或STI571联合应用可显著促进K562细胞凋亡。机制分析显示，联合治疗组可显著提升Bax/Bcl-2的比值。
　　结论：酪氨酸激酶抑制剂在CML的治疗中发挥了重要的作用，尤其是STI571的问世，大大提高了CML患者的生存时间和生存率。但是，随着STI571的大规模使用，STI571耐药性的问题凸显，这就要求我们在抑制Bcr-abl的同时，探寻新的治疗靶点以提高CML的治疗效果。P15INK4b作为经典的肿瘤抑制因子，具有抑制细胞周期蛋白激酶的功效。我们的研究显示，与单独应用Bcr-abl siRNA转染、STI571治疗或 P15INK4b慢病毒转染相比，联合应用 P15INK4b慢病毒转染与Bcr-abl及STI571可显著抑制K562细胞的增殖，增加细胞凋亡率，提示我们联合应用P15INK4b慢病毒感染与Bcr-abl siRNA及STI571可能具有提高CML治愈率的潜能，P15INK4b具有成为Bcr-abl以外治疗CML的潜在靶点的可能性。

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缩略语表

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前言

文献回顾

实验一 P15INK4b慢病毒表达载体的构建、包装及鉴定

前言

1.材 料

2.方 法

3.结 果

4.讨 论

5.小 结

实验二 P15INK4b基因慢病毒包装

1.材 料

2.方 法

3.结 果

4.讨 论

5.小 结

实验三 P15INK4b慢病毒感染K562细胞

1.材 料

2.方 法

3.结 果

4.讨 论

5.小 结

实验四 Bcr-abl siRNA的合成及效能鉴定

1.材 料

2.方 法

3.结 果

4.讨 论

5.小 结

实验五 P15INK4b与Bcr-abl siRNA/STI571联合治疗对K562细胞的影响

1.材 料

2.方 法

3.结 果

4.讨 论

5.小 结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢