受体型酪氨酸激酶TrkB通过抗脱落凋亡作用参与结肠癌转移的分子机制研究

摘要

结肠癌是我国最常见的恶性肿瘤之一,其恶性侵袭能力及转移作用被认为是导致预后不良的主要原因。结肠癌继发性转移往往导致患者手术及化疗效果不佳,并影响预后。证据表明,恶性肿瘤抗脱落凋亡能力在肿瘤转移中发挥了巨大的作用。脑源性神经营养因子受体型酪氨酸激酶B(TrkB),广泛参与了肿瘤细胞存活、增值和侵袭等生物学作用。而最新研究表明,TrkB还具有促进细胞抗脱落凋亡的重要生物学功能。TrkB在多种人类恶性肿瘤中呈现高表达状态,如神经母细胞瘤、肺癌、前列腺癌和胰腺癌等。在关于胃癌的研究中,TrkB被证实与患者预后密切相关。以上的各种证据表明,TrkB在肿瘤的各项生物学功能中发挥了重要作用。我们希望能够更加深入的研究TrkB介导的抗脱落凋亡在结肠癌细胞高转移特性中所起到的作用,这将有可能通过抑制结肠癌细胞抗脱落凋亡作用,找到阻断其远端脏器转移能力的新疗法。本课题将就此进行探讨。
　　目的:
　　首先,通过细胞学实验和体内实验,论证TrkB在结肠癌细胞抗脱落凋亡生物学特性中发挥关键性作用,并能够促进肿瘤远端转移灶的形成。更进一步,检测与肿瘤细胞凋亡相关的关键性效应分子,从而初步阐明TrkB参与结肠癌凋亡抵抗的分子机制。最后,通过对临床病理标本石蜡切片进行免疫组织化学染色,分析TrkB表达水平与结肠癌患者预后的相关性。本研究旨在为进一步明确结肠癌转移的分子机制奠定理论基础,并为有效评估结肠癌患者预后提供实验依据。
　　方法:
　　首先,我们在多种结肠癌细胞系中检测了TrkB分子的表达水平。通过免疫组织化学染色检测了结肠癌患者临床病理标本石蜡切片中TrkB的表达水平。随后,分别构建了用于上调TrkB表达水平的逆转录病毒体系及沉默TrkB表达水平的慢病毒体系。建立不同Trkb表达水平的结肠癌稳定感染细胞系。通过结肠癌细胞悬浮培养模型,模拟肿瘤细胞在血管或淋巴管内完成远端转移时悬浮生长的特殊环境,并应用流式细胞术检测不同TrkB表达水平结肠癌细胞在贴壁及悬浮生长状态下的凋亡水平。通过小鼠肿瘤细胞肺转移模型进一步验证细胞学实验的结果。另外,我们检测了在不同TrkB表达水平下,凋亡相关效应分子的活化水平,并通过加入其特异性抑制剂验证抑制该分子活性是否可以阻断TrkB对结肠癌细胞的抗脱落凋亡作用,初步明确TrkB参与结肠癌凋亡抵抗的分子机制。最后,收集整理结肠癌患者临床及预后资料,通过免疫组织化学染色评分,统计分析TrkB分子表达水平与患者预后的相关性。
　　结果:
　　我们应用Western blot检测了不同结肠癌细胞系TrkB的表达水平,结果提示,结肠癌细胞SW480、HCT116、HT29和LoVo细胞TrkB表达水平明显高于人胃黏膜细胞 GES。其中 SW480细胞与其它结肠癌细胞相比,TrkB表达水平较低。相反,LoVo细胞的TrkB表达水平相对较高。运用免疫组织化学染色检测了60例结肠癌患者术后病理切片的TrkB表达水平,结果显示癌组织中的TrkB表达水平明显高于癌旁组织(P<0.001)。于此同时,我们成功构建TrkB特异性发卡RNA(shRNA)的干涉载体,并包装慢病毒体系。同时也包装了上调TrkB表达水平的逆转录病毒体系。根据第一部分实验结果,对高本底TrkB表达水平的LoVo结肠癌细胞系进行基因干涉,建立了TrkB表达下调的shRNA-TrkB-LoVo细胞系;对于本底TrkB表达水平较低的SW480结肠癌细胞系,则建立了上调TrkB表达的pBABE-puro-TrkB SW480细胞系。应用流式细胞术检测不同TrkB表达水平的结肠癌细胞的抗脱落凋亡能力,我们观察到随着TrkB表达的下调,LoVo结肠癌细胞系的抗脱落凋亡能力也随之下降。而当上调 SW480细胞系的Trkb表达水平后,其抗脱落凋亡能力也随之增强。在体内实验中,经小鼠尾静脉注射不同TrkB表达水平的LoVo细胞,2周后处死小鼠并行肺组织切片HE染色可见,注射TrkB本底表达较高的LoVo细胞的实验组小鼠在肺部出现数目较多,体积较大的继发性癌转移灶。而应用shRNA干涉技术下调TrkB表达水平的对照组小鼠,其肺部癌转移灶数量明显较少。通过生存曲线可见,当下调 LoVo细胞的TrkB表达水平后,该组小鼠的生存率也高于未经处理的正常 LoVo细胞实验组。随后,通过对凋亡相关分子Akt磷酸化水平的检测,我们发现Akt磷酸化水平与TrkB表达模式密切相关,即下调TrkB的表达水平后,Akt磷酸化水平随之降低;相反,上调TrkB的表达后,Akt磷酸化水平随之升高。LoVo细胞TrkB表达水平较高,其抗脱落凋亡能力也较强,但加入Akt抑制剂阻断了 Akt活化后,同样会显著降低 LoVo细胞的抗脱落凋亡能力。由此可以初步明确,TrkB通过其下游效应分子Akt的磷酸化,参与结肠癌抗脱落凋亡作用。最后,通过免疫组织化学染色,对结肠癌组织中不同TrkB染色强度进行统计学分析,TrkB高表达组与TrkB低/阴性表达组之间,可见组间生存率存在明显的统计学差异(P=0.004,Log-Rank test),TrkB高表达提示临床预后不良,TrkB是结肠癌患者预后不良的重要预测因子。
　　结论:
　　本研究通过体内及体外实验,相关通路分子机制的探讨以及临床样本分析,初步阐明了TrkB通过其下游分子Akt磷酸化,影响结肠癌细胞的抗脱落凋亡能力,并促进结肠癌的远端脏器转移,最终导致结肠癌患者预后不良。这有利于临床工作者和科研人员深入理解结肠癌的恶性侵袭特性和其远端脏器转移机制,为研发抑制结肠癌远端脏器转移的新疗法提供了合理的思路和相关理论基础。

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缩略语表

中文摘要

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前言

文献回顾

一、脱落凋亡：广泛存在于贴壁细胞的死亡程序

二、TrkB分子与肿瘤

三、Akt与肿瘤及凋亡

正文

实验一 TrkB在不同结肠癌细胞系及肿瘤组织中的表达

1 材料

2 方法

3. 结果

4 讨论

实验二 上调/下调Tr kB表达水平对结肠癌细胞抗凋亡能力的影响

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

实验三 TrkB参与小鼠继发性肿瘤远端转移的研究

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

实验四 TrkB参与结肠癌细胞抗脱落凋亡的机制研究

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

实验五 TrkB表达水平与结肠癌患者预后相关性的研究

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

小结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢