沙利度胺对慢性神经病理性痛和炎性痛的防治作用及其相关机制的研究

摘要

研究背景：
　　全球每年约有7％的普通人群饱受慢性疼痛的折磨,严重影响着患者的生活质量。但由于对慢性疼痛的具体发生发展机制迄今仍未完全阐明,因此导致对其的临床治疗也缺乏突破。近年来,越来越多的研究发现脊髓背角的星形胶质细胞和小胶质细胞活化及炎性因子的释放都与慢性疼痛的发生和发展有着密切的关系。因此以胶质细胞活化和炎性反应为研究慢性疼痛的新靶点,可能为临床提供更多更有效的治疗方法和新的治药物。
　　当外周神经受到损伤后,神经胶质细胞可以通过释放TNF-α等炎性因子,改变神经递质清除能力,促进痛觉信息的异常放大,形成痛觉敏化,通过抑制胶质细胞的活化,减少促炎因子的释放则疼痛得到抑制。有研究证实,使用TNF-α的中和抗体或者受体的拮抗剂可以缓解神经损伤诱导的慢性疼痛,沙利度胺(Thalidomide,Tha)就是其中之一种。
　　Tha是一种谷氨酸衍生物,具有很好的抗炎和免疫调节作用。有研究表明,Tha可以选择性地抑制单核巨噬细胞分泌TNF-α,同时促进TNF-α的降解而发挥镇痛作用。最近的动物实验研究结论已经证实了Tha可以缓解外周神经系统损伤所导致的慢性疼痛,然而,其参与慢性疼痛的镇痛机制尚不完全清楚。
　　综上,本课题以Tha为工具药,研究其对两种慢性疼痛即神经病理性痛和炎性痛是否有镇痛作用、发挥镇痛作用的方式、预防和治疗的时间窗以及其发挥镇痛作用的胶质细胞和炎性因子相关机制,为进一步阐明慢性疼痛的相关发生机制和临床治疗慢性疼痛提供理论依据。
　　研究方法：
　　本课题分别通过实验大鼠脊神经结扎和足底注射福尔马林的方法制作神经病理性痛和炎性疼痛动物模型;通过行为药理学方法观察实验动物的热痛敏反应潜伏期和机械性痛觉异常反应潜伏期;并通过免疫荧光化学和Western Blot蛋白定量方法观察脊髓背角相关细胞和分子在慢性疼痛过程中的变化,分别在整体动物、细胞以及分子水平研究和观察Tha对慢性痛发生发展的作用。
　　研究结果：
　　第一部分研究内容观察到:
　　(1)在SNL模型建立前即腹腔给予Tha(20 mg/kg)预处理后,能明显的抑制由SNL介导的大鼠机械性痛;
　　(2)在SNL模型建立后第3、5、7、14 d分别Tha(20 mg/kg)干预能显著提高大鼠的机械性缩足阈值;
　　(3)在坐骨神经结扎(Spinal nerve ligation,SNL)模型建立后不同时间点(0、3、7、14 d)大鼠手术侧脊髓背角的GFAP和Iba1比假手术组表达量明显增多,但各时间点腹腔给予Tha(20 mg/kg)胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)和离子钙结合衔接分子1(Iba1)表达量减少;
　　(4)Western blot结果显示SNL所致的神经病理性疼痛大鼠脊髓背角肿瘤坏死因子-α(TNF-α)分子在术后3～14 d表达增多,然而给予Tha干预后,表达量则明显减少。
　　第二部分研究内容观察到:
　　(1)大鼠足底皮下注射5%福尔马林50μl后,能引起典型的双时相(phaseⅠ、phaseⅡ)自发痛行为,第一时相是福尔马林注射后直接由机械性刺激损伤组织而引起的急性疼痛,随后会出现一个持续超过40 min慢反应过程称第二时相,是由注射的福尔马林引起的炎症反应而导致的持续疼痛;
　　(2)模型建立前2h经灌胃给予布洛芬(20 mg/kg)和不同剂量的Tha(10、20、30 mg/kg)干预后能够明显的抑制福尔马林介导的大鼠第一时相和第二时相的痛行为,布洛芬与各沙利度胺治疗组之间没有明显区别;
　　(3)福尔马林注射组的脊髓背角内,Iba1阳性小胶质细胞、P物质(SP)阳性终末以及FOS蛋白的表达量均增多,而给予不同剂量(10、20、30 mg/kg)的Tha处理组与0.9%生理盐水治疗对照组相比表达量呈明显的下降趋势;
　　(4)福尔马林注射组大鼠中脑导水管周围灰质(Periaqueductal gray,PAG)腹外侧区、前扣带回皮质(Anterior cingulate cortex,ACC)、岛叶皮质(Insular cortex,IC)、前额叶皮质(Prefrontal cortex,PFC)等区域,均有大量的FOS阳性神经元表达,然而沙利度胺(20 mg/kg)治疗组同一区域内的FOS阳性神经元数量明显下降;
　　(5)正常对照组的Ibal阳性小胶质细胞为静息状态,主要呈细长、分枝状的细胞,LPS+生理盐水组的Ibal阳性小胶质细胞为激活状态,细胞体积增大、变为圆形,甚至呈阿米巴样的细胞,而Tha干预可以减轻LPS刺激对小胶质细胞形态的影响,使激活状态的细胞数量明显减少;
　　(6)LPS+生理盐水组的GFAP阳性细胞较正常对照组相比,细胞胞体变大,突起回缩;而Tha干预可以减轻LPS刺激对星形胶质细胞形态的影响;
　　(7)与正常对照组相比,LPS+生理盐水组TNF-α、白介素-1β(IL-1β)、白介素-6(IL-6)和白介素-10(IL-10)的表达明显增多,而Tha干预可以降低TNF-α、IL-1β、和IL-6的表达量,但对IL-10的表达却没有明显影响。
　　小结：
　　本研究通过动物模型模拟了临床常见的两种慢性疼痛,即神经病理性痛和炎性痛,两者的发生机制都有胶质细胞及其相关的细胞因子引起的神经免疫应答反应参与其中。应用Tha可以预防和缓解上述两种慢性疼痛,同时抑制胶质细胞激活,还可以下调神经免疫应答反应。这些研究结论为临床治疗慢性疼痛提供了新的理论依据和治疗策略。

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缩略语表

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前言

文 献 回 顾

1 神经病理性痛信息的神经传导机制

2 神经病理性痛与脊髓星形胶质细胞的关系

3 沙利度胺(Thalidomide) 、TNF-α与慢性痛

4 Tha与炎性痛

5 胶质细胞的原代培养

6 脊神经结扎致神经病理性痛模型

7 福尔马林致急性炎性痛模型

正文

第一部分 沙利度胺对神经病理性痛的防治作用及其相关机制的研究

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

第二部分 沙利度胺对炎性痛的防治作用及其相关机制的研究

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

小结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢