针对NgR1和PirB靶向治疗改善小鼠脑缺血后神经功能的研究

摘要

脑卒中是中国成年人中致死、致残的首要病因,同时也是西方国家第二大致死病因。不仅如此,脑卒中后的幸存者还相继发生了偏瘫、失语等后遗症从而使这些人的生活质量严重下降。目前,纤维蛋白溶解疗法和抗血小板聚集药物的应用是治疗脑卒中最有效的方法。但是这些疗法时间窗狭窄(<4.5h),只有约10％的脑卒中后患者适用于再此疗法且不能解决术后多种后遗症。至今为止,脑卒中后神经功能障碍的有效方法仅有复健锻炼,但这种方法所需时间长且收效甚微。因此,研制出有效药物从根本上解决脑卒中后长期的神经功能障碍刻不容缓。
　　Nogo-A蛋白的发现,为治疗中风后神经功能障碍带来了希望。Nogo-A有抗CNS损伤后的突触重建的作用。NgR1是Nogo-A的受体,抑制NgR1能促进轴突再生。我们前期研究发现,包含Nogo-A特定功能区域的TAT-M9蛋白无论在体内还是体外实验中均能在急性期减少活性氧的生成,抑制细胞凋亡。同时,NgR1的抗体蛋白TAT-NEP1-40能抑制Nogo-A作用增强大鼠脑缺血后短期的神经突触可塑性和神经功能。而最近报道称,脑缺血损伤后28天内神经元Nogo-A的表达在脑损伤早期(7d)下降,之后逐渐升高。依据Nogo-A在脑缺血后的空间表达特异性,我们拟用TAT-M9进行急性期(7d)的抗凋亡治疗,Nogo-A表达高峰时应用TAT-NEP1-40促进突触重建,深入研究联合应用TAT-M9和TAT-NEP1-40的长期保护作用,为缺血性脑卒中提供新的治疗方法。
　　PirB也是髓磷脂蛋白的功能性受体。有研究发现,基因敲除PirB后会引起比敲除NgR1更多的轴突再生。故此,推测PirB在髓磷脂抑制作用中占有更大的比例,提示PirB也可能成为脑卒中后康复治疗的又一个作用靶点。为了抑制PirB的作用,我们利用PirB的细胞外段合成了PEP。然而,PEP的分子量过大,不能通过血脑屏障。因此,我们应用蛋白转导技术再一次合成了具有血脑屏障通透性的TAT-PEP融合蛋白。为进一步明确PirB对缺血性脑卒中的治疗作用提供了研究基础。
　　因此,本课题以小鼠全脑缺血(BCCAO)模型和海马神经元细胞系HT22氧糖剥夺(OGD)模型为对象,应用免疫组织化学、蛋白印记和神经行为学等方法,观察联合应用TAT-M9和TAT-NEP1-40及TAT-PEP对脑缺血损伤后长期神经保护作用,旨在提供针对缺血性脑卒中治疗新的干预目标和药物,并且脑卒中后的治疗模式提供新思路。
　　实验一:TAT-M9对脑缺血损伤急性期的保护作用
　　目的:对小鼠全脑缺血7d后TAT-M9脑保护作用的观察。
　　方法:采用C57BL/6小鼠,建立BCCAO模型,将小鼠随机分为三组: Sham组(假手术组,n=6),Control组(0.5ml生理盐水,qd ip,n=6)和TAT-M9组(10mg/kg,qd ip,n=6),再灌注即刻给药,之后每天同一时间段行药物腹腔注射,连续7d。于首次药物注射6h后,通过免疫组化染色观察药物通过血脑屏障情况。于第7d行总体运动评分(TMS)观察BCCAO小鼠术的自主神经运动能力。应用HE染色观察并计数脑缺血7d后神经元的存活情况。采用TUNEL染色观察并计数小鼠缺血后7d海马神经元的凋亡情况,通过western blot明确Bcl-2和Bax在海马的表达情况。
　　结果:成功建立了BCCAO模型,观察到TAT-M9可通过血脑屏障进入脑缺血区,并表达于海马神经元。TAT-M9治疗可改善BCCAO术7d小鼠的TMS评分(P<0.01)。TAT-M9治疗使BCCAO术后海马CA1区存活神经元数量显著增加(P<0.01)。TAT-M9治疗还可显著减少BCCAO术后7d海马CA1区TUNEL阳性神经元数目(P<0.01),同时TAT-M9还提高Bcl-2/Bax的相对值(P<0.01)。
　　结论:TAT-M9能穿过血脑屏障进入脑海马 CA1区和神经元内,减少脑缺血再灌注损伤急性期(7d)的神经元损伤,抑制神经凋亡,减少神经元丢失,促进神经元存活,改善小鼠的自主神经运动能力。
　　实验二:联合应用TAT-M9与TAT-NEP1-40对脑缺血损伤的长期保护作用
　　目的:观察联合应用TAT-M9与TAT-NEP1-40对小鼠全脑缺血损伤后的长期神经保护作用
　　方法:采用C57BL/6小鼠,建立BCCAO模型,小鼠随机分成四组:Control组(0.5ml生理盐水,qd ip,n=30),TAT-M9组(10mg/kg,qd ip,n=30),TAT-NEP1-40组(6mg/kg,qd ip,n=30),TAT-M9+TAT-NEP1-40组。TAT-M9组于再灌注即刻给药,持续7d;TAT-NEP1-40组于第8d给药,持续至28d;TAT-M9+TAT-NEP1-40组于再灌注即刻给予TAT-M9,连续7d,从第8d给予TAT-NEP1-40,持续至28d。于BCCAO后28d通过被动回避平台实验、高架十字迷宫和恐惧箱实验鉴定治疗后小鼠的短期记忆能力。应用旷场实验检测小鼠自主运动功能。应用Morris水迷宫和T迷宫观察小鼠长期记忆能力。通过免疫荧光染色观察注射6h后TAT-NEP1-40通过血脑屏障,及治疗28d后缺血区轴突生长情况。通过western blot明确28d后BCCAO小鼠轴突生长因子(Tau、GAP43和MAP2)表达量的变化情况。
　　结果:成功建立了BCCAO模型,观察到TAT-NEP1-40通过血脑屏障并表达于海马神经元。TAT-M9和TAT-NEP1-40联合治疗能促进Tau、GAP43和MAP2的表达(P<0.01),促进海马CA1区神经元轴突生长。TAT-M9和TAT-NEP1-40联合治疗还能提高BCCAO小鼠28d后短期空间学习和记忆能力(P<0.01)及短期的关联性和条件暗示性记忆能力(P<0.05);TAT-M9和TAT-NEP1-40联合治疗也改善了BCCAO小鼠28d后长期空间学习和记忆能力(P<0.01)以及长期工作记忆和参考记忆能力(P<0.01)。
　　结论:长时程联合应用TAT-M9和TAT-NEP1-40能促进损伤区神经轴突再生,提高脑缺血损伤后小鼠短期及长期的空间学习记忆能力,促进缺血损伤后的神经功能恢复。
　　实验三:TAT-PEP对氧糖剥夺HT22细胞的保护作用及轴突生长的影响
　　目的:通过离体研究,明确TAT-PEP是否能促进氧糖剥夺(OGD)的HT22细胞的轴突再生。
　　方法:采用小鼠海马神经元细胞系HT22细胞,首先应用MTT确定TAT-PEP的最佳有效浓度。其次将细胞分为三组:Sham组、OGD组、OGD+TAT-PEP组,细胞复氧后24h后,免疫荧光染色观察3d后细胞轴突再生情况。
　　结果:当TAT-PEP浓度为150μg/L时,OGD后细胞存活数最多。且TAT-PEP显著促进OGD模型24h后的神经元轴突生长。
　　结论:TAT-PEP可作用于神经元,促进神经突的再生。
　　实验四:TAT-PEP长期治疗对脑缺血损伤保护与神经功能的影响
　　目的:通过在体实验,明确TAT-PEP对小鼠全脑缺血后是否具有长期的神经保护效应
　　方法:采用 C57BL/6小鼠,建立 BCCAO模型,将小鼠随机分为三组: Sham组(假手术组,n=40),Control组(0.5ml生理盐水,qd ip,n=40)和TAT-PEP组(150μg/kg,qd ip,n=40),再灌注即刻给药,连续28d。首次药物注射6h、24h、48h后通过免疫荧光染色观察药物通过血脑屏障情况。应用HE染色和Nissl染色观察并计数BCCAO小鼠7d后神经元的存活情况。采用TUNEL染色统计BCCAO小鼠7d后神经元的凋亡情况,应用 FJC染色统计 BCCAO小鼠7d后神经元变性情况。通过western blot明确28d后BCCAO小鼠轴突生长因子(Tau和GAP43)表达量的变化情况。MAP2免疫荧光检测损伤区轴突再生情况。通过被动回避平台试验、高架十字迷宫和恐惧箱实验鉴定治疗后小鼠的短期记忆能力。应用旷场实验检测小鼠自主运动功能。应用Morris水迷宫和T迷宫观察小鼠长期记忆能力。
　　结果:成功建立了BCCAO模型,观察到TAT-PEP通过血脑屏障表达于海马神经元,并于24h是表达量最高。TAT-PEP治疗可明显增加BCCAO术后7d神经元在海马CA1区的存活数量(P<0.01);TAT-PEP治疗显著增加BCCAO术后7d海马CA1区Nissl阳性神经元数目(P<0.01);TAT-PEP治疗可显著减少BCCAO术后7d海马CA1区TUNEL阳性神经元数目(P<0.01);TAT-PEP治疗还可显著减少BCCAO术后7d海马CA1区FJC阳性神经元数目(P<0.01)。TAT-PEP治疗能促进Tau(P<0.05)及GAP43(P<0.01)的表达,促进海马CA1区神经元轴突生长。TAT-PEP治疗还能提高BCCAO小鼠28d后短期空间学习记忆能力(P<0.05,P<0.01)及短期的关联性和条件暗示性记忆能力(P<0.05);TAT-PEP治疗也改善了BCCAO小鼠28d后长期空间学习记忆能力(P<0.05,P<0.01)以及长期工作记忆和参考记忆能力(P<0.05,P<0.01)。
　　结论:TAT-PEP治疗能减少脑缺血损伤后短期的神经元的变性和凋亡,促进神经元的存活。促进损伤区神经轴突再生,提高脑缺血损伤后小鼠短期和长期的记忆能力。
　　小结:以上研究证实,TAT-M9、TAT-NEP1-40和TAT-PEP均能通过BBB,作用于损伤神经元;TAT-M9可以减少缺血损伤区的神经元丢失,抑制凋亡,改善缺血急性期的神经功能;联合应用TAT-M9和TAT-NEP1-40治疗显著促进轴突再生,对缺血性损伤后的小鼠的长期和短期的空间学习及记忆能力均明显提高,强效且长久的改善小鼠的神经功能;TAT-PEP不仅在缺血早期增加损伤区的神经元存活,抑制凋亡,并且长期治疗后还能促进轴突再生,提高小鼠长期和短期的空间学习及记忆功能,促进小鼠缺血晚期的神经功能恢复。本项研究为今后由CNS相关疾病引起的神经功能障碍患者的康复治疗提供新的治疗靶点、治疗方法及药物。

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缩略语表

中文摘要

英文摘要

前言

文献回顾

1脑卒中的流行病学及治疗现状

2．轴突生长抑制因子Nogo-A及其受体的研究进展

3.TAT蛋白转导技术

正文

实验一、TAT-M9对脑缺血损伤急性期的保护作用

1材料

2方法

3.结果

4讨论

实验二、联合应用TAT-M9与TAT-NEP1-40对脑缺血损伤的长期保护作用

1.材料

2方法

3.结果

4. 讨论

实验三、TAT-PEP对氧糖剥夺HT22细胞的保护作用及轴突生长的影响

2方法

3结果

4讨论

实验四、TAT-PEP长期治疗对脑缺血损伤保护与神经功能的影响

1材料

2方法

3结果

4. 讨论

小结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢