电针预处理通过CB1R上调TGF-β1发挥脑保护作用的研究

摘要

“随着社会人口结构老龄化问题日益严重,我国中风发生率以每年8.7％的速度增长,其中缺血性卒中占80%。我国脑卒中发病率居世界第一,脑卒中已成为我国第一位死因和成年人首要的致残病因,严重影响生活质量,给患者及其家庭和社会带来极大的精神及经济负担[1,2,3,4]。经典的溶栓剂治疗,即重组组织型纤溶酶元激活物(rtPA),因其治疗时间窗短(中风发生后3-4.5h),增加治疗期间颅内出血风险,在临床应用受限,仅有约5%的中风患者可以得到及时有效的溶栓治疗;另外对复发型及合并心血管疾病的中风患者抗血小板治疗需严格的适应症征和精确的用药剂量防止更为严重的并发症。因此,中风的治疗需要更加科学的策略,为中风患者和家庭寻找更加有效的防治措施将成为今后研究的重点和热点方向。”
　　“随着对中风病理机制的研究进一步深入,现在认识到:兴奋性毒性、梗死周围去极化、神经炎症和程序性细胞死亡各种导致缺血损伤的机制,由缺血引发,在不同时相相互重叠紧密联系。这种缺血级联反应在脑缺血发生后几分钟内引起不可逆的神经元损伤,中枢系统神经炎症反应参与了由血液供应中断而引发的急性脑血管事件的各个病理生理阶段,不但导致脑缺血损伤并且参与了随后的神经组织修复的进程。由此可见,神经炎症是脑卒中导致缺血再灌注损伤及神经恢复的重要因素,研究脑缺血损伤的炎症机制将是神经保护研究的热点和重点。我们实验室之前的研究证实电针预处理可上调脑缺血再灌注后大鼠脑内神经元α7nAChR表达,显著降低脑再灌注损伤后脑组织和血浆中促炎因子HMGB1水平,抑制神经系统炎症产生脑保护作用,然而电针在神经系统中的抗炎作用机制相关研究远未揭示,有待进一步阐明。另外我们证实电针在缺血前和缺血发生后通过大麻素系统上调脑缺血周围组织 CB1R受体激活内源性保护机制而发挥脑保护作用,而最新的体外实验研究证实大麻素参与了神经炎症反应,有明显的抗炎作用。内源性大麻素系统对炎症反应的作用机制是目前的研究热点,然而其机制并不完全清楚,其与炎症介质和炎症因子的交互作用是复杂而多向的。”
　　“转化生长因子β(TGF-β)是具有多种功能的细胞因子,其在抑制神经炎症中的作用已被认可,TGF-β在中枢神经及某些外周器官的发育和形成过程中扮演重要角色,具有神经保护作用。TGF-β可影响脑缺血后活化的小胶质细胞的功能状态发挥脑保护作用,各种脑损伤或疾病均可诱导TGF-β表达,并表现出其神经保护作用。在中枢内源性大麻素系统与TGF-β交互作用于小胶质细胞产生一定的保护作用。由此,本研究一方面着眼于TGF-β可能是电针脑保护机制的重要组成部分,另一方面明确内源性大麻素系统与TGF-β的关系,为临床治疗中风提供更加充分的理论依据及新的手段和靶点。”
　　实验一:电针预处理对脑缺血后TGF-β1表达的影响
　　目的:观察电针预处理对缺血再灌注后大鼠脑组织半暗带TGF-β1表达变化的影响。
　　方法:
　　1.电针的脑保护作用
　　见以往的电针脑保护研究。
　　2.在脑缺血再灌注损伤后半暗区TGF-β1的表达变化及电针对TGF-β1表达影响雄性SD大鼠根据缺血再灌注损伤后时间点不同随机分为8组(n=6):假手术组(Sham)、再灌注后2h、4h、6h、12h、24h、48h及72h,在各时间点将动物处死取脑并切取半暗带,提取组织蛋白,Western Blot检测不同时间点TGF-β1的表达情况。
　　雄性SD大鼠分组同I,再灌注24h后处死动物(n=6),运用western blot观察该时间点各组TGF-β1的表达情况
　　3.电针刺激对半暗区神经元TGF-β1表达量的影响
　　雄性SD大鼠随机分为3组(n=4),拔除线栓再灌注24h,将动物处死,多聚甲醛灌流固定脑组织,冰冻组织切片后进行免疫荧光染色。同时将TGF-β1与神经元的标记物NeuN进行免疫荧光双标染色。
　　结果:
　　Western blot结果显示,再灌注损伤发生后6h,缺血再灌注组TGF-β1表达量较Sham组显著上调(P<0.05),其中以24小时表达量较高。缺血再灌后24小时,与I/R组相比,EA组半暗带组织中的TGF-β1含量明显增高(P<0.05)。使用TGF-β1和神经元的标记物 NeuN双标记,其结果显示电针预处理脑缺血再灌注损伤后24h TGF-β1表达在神经元细胞上明显增多。
　　结论:
　　缺血再灌注后脑缺血周围组织TGF-β1表达增高,电针预处理可进一步上调其表达发挥脑保护作用,电针预处理可在缺血后24小时上调神经元TGF-β1表达。
　　实验二:TGF-β1在电针脑保护中的作用研究
　　目的:观察下调TGF-β1表达对电针保护作用的影响及外源性 TGF-β1的对脑缺血再灌注损伤的影响
　　方法:
　　雄性SD大鼠,随机分为6组(n=8):Sham组、I/R组、EA组和EA+TGF-β1干扰RNA组、EA+MAB240(TGF-β1中和抗体)组、I/R+重组TGF-β1。缺血前48h侧脑室注射TGF-β1干扰RNA(25nmol);缺血前0.5h,侧脑室注射MAB240(TGF-β1中和抗体)(0.4 mg/kg),重组TGF-β1(0.8 ug/Kg),容量均为10ul。动物经历2h缺血后于再灌注72h处死,进行神经行为学评分和脑梗死容积测定。
　　结果:
　　再灌注72h,EA组脑梗死容积较I/R组显著降低(P<0.05),并且神经行为学评分较I/R组有所改善(P<0.05)。EA+siRNA和EA+MAB240与EA组相比梗死面积显著增加(P<0.05),而I/R+重组TGF-β1组与I/R组相比脑梗死容积明显减少(P<0.05),产生了与电针预处理相似的作用。与EA组相比,EA+siRNA组和EA+MB240行为学评分明显降低(P<0.05),与I/R组相比外源性给予重组TGF-β1可显著改善大鼠脑缺血再灌注后72小时的神经行为学评分(P<0.05)。
　　结论:
　　下调TGF-β1的表达可以逆转电针预处理的脑保护作用,而外源性TGF-β1可模拟电针的脑缺血耐受作用
　　实验三:TGF-β1在电针预处理抗凋亡中的作用研究
　　目的:进一步观察TGF-β1对电针预处理脑缺血再灌注损伤后神经细胞凋亡及凋亡相关蛋白表达的影响
　　方法:
　　1.TGF-β1对神经细胞凋亡的影响
　　雄性SD大鼠,用随机数字法随机分为5组(n=4):Sham组、I/R组、EA组、EA+TGFβ-siRNA组及I/R+重组TGF-β1组。缺血前48h,进行TGF-β1-siRNA(25nmol)侧脑室注射,缺血前0.5h重组TGF-β1(0.8 ug/Kg)侧脑室注射,容量均为10ul。动物经历2h缺血后于再灌注后24h处死,灌流后制作石蜡切片,进行TUNEL染色,观察各组切片神经细胞凋亡数量的变化。
　　2.TGF-β1对凋亡相关蛋白表达的影响
　　雄性SD大鼠随机分为分5组(n=6):Sham组、I/R组、EA组、EA+siRNA组和I/R+rhTGF-β1组。于再灌注24h处死取缺血半暗带,通过western blot对Bcl-2和Bax进行蛋白定量分析,观察对凋亡相关蛋白表达量的影响。
　　结果:
　　EA组中 TUNEL阳性细胞的数量较I/R组(P<0.01)显著减少,EA+siRNA组较EA组显著增多(P<0.01)。I/R组Bax/Bcl-2的比率较Sham组升高(P<0.05)。EA组Bax/Bcl-2的比率较I/R组则显著下调(P<0.05)。电针预处理组给予TGF-β1-siRNA侧脑室注射则可以显著下调 Bcl-2的表达并上调 Bax的表达而增加两者的比值(P<0.05)。而I/R组予以侧脑室注射重组TGF-β1可显著降低两者比值(P<0.05)。
　　结论:
　　下调TGF-β1能够增加大鼠脑缺血再灌注损伤后神经细胞的凋亡,拮抗电针预处理的脑保护作用,而重组的TGF-β1减轻缺血后神经系统的损伤,产生拟电针样脑保护作用,说明TGF-β1通过对抗凋亡,在电针脑保护作用中发挥了重要的作用。
　　实验四电针通过大麻素CB1调控TGF-β1表达的研究
　　目的观察电针预处理对脑缺血再灌注损伤后大麻素对TGF-β1的表达的影响
　　方法
　　1.CB1受体拮抗剂对电针预处理后TGF-β1表达的影响
　　雄性SD大鼠,随机分为4组(n=6):I/R组、EA+I/R组、EA+AM251(SR141716A)组和EA+DMSO组。电针预处理2h后制作脑缺血模型,制作模型前0.5h腹膜内注射AM251(SR141716A),剂量为1mg/kg(1.5mg/kg),于再灌注损伤后24h处死取皮层半暗带,Western Blot测定半暗带TGF-β1表达含量。
　　2.CB1受体的干扰RNA对电针预处理后TGF-β1表达的影响
　　雄性SD大鼠,分组同前:I/R组、EA+I/R组、EA+CB1R-siRNA组和EA+Vehicle组。电针预处理2h后制作脑缺血模型,制作模型前48h侧脑室内注射CB1R-siRNA(10μg/10μl),于再灌注损伤后24h处死取皮层半暗带,Western Blot测定半暗带TGF-β1表达含量。
　　3.CB1受体激动剂ACEA对电针预处理后TGF-β1表达的影响
　　雄性SD大鼠,随机分为3组(n=6):I/R组、I/R+ACEA组和I/R+Vehicle组。制作模型前0.5h腹膜内注射ACEA,剂量为2.5 mg/kg,于再灌注损伤后24h处死取皮层半暗带,Western Blot测定半暗带TGF-β1表达含量。
　　结果
　　再灌注后24h测得 EA+AM251组半暗带 TGF-β1的相对表达含量较 EA组和EA+DMSO组显著降低(P<0.05);EA+SR141716A组半暗带TGF-β1的相对表达含量较EA组和EA+DMSO组显著降低(P<0.05);EA+CB1-siRNA组TGF-β1表达量较EA组EA+Vehicle组显著降低(P<0.05);I/R+ACEA组TGF-β1表达相对含量较I/R组和I/R+vehicle组显著上调(P<0.05)。
　　结论
　　电针预处理的同时给予CB1受体的拮抗剂AM251、SR141716A和CB1受体的干扰RNA,抑制CB1受体的生物活性,发现两类药物能够逆转电针预处理后TGF-β1表达的上调;与之相反现象的是,实验中给予CB1受体的受体激动剂ACEA,则能够模拟电针预处理后TGF-β1表达的上调,提示电针预处理可通过上游CB1受体调节TGF-β1的表达发挥脑保护作用。
　　小结
　　1.电针预处理可以改善脑缺血再灌注损伤后神经行为学评分和脑梗死容积,增加缺血半暗带TGF-β1的表达。
　　2.抑制TGF-β1分子可以部分逆转电针预处理的神经保护作用。
　　3.抑制TGF-β1分子可以增加脑缺血再灌注损伤后神经细胞的凋亡数量。
　　4.电针预处理通过上游CB1受体对TGF-β1分子的表达进行调控。

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缩略语表

中文摘要

英文摘要

前言

文献回顾

一、神经炎症对于脑缺血再灌注损伤的意义——“双刃剑机制”

二、电针抗炎机制的研究现状

三、抗炎因子TGF-β1与神经保护作用的研究进展

正文

实验一电针预处理对脑缺血后TGF-β1表达的影响

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

实验二TGF-β1在电针脑保护中的作用研究

1 材料与试剂

2 方法

3 结果

4 讨论

实验三TGF-β1在电针预处理抗凋亡中的作用研究

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

实验四电针通过大麻素CB1受体调控TGF-β1表达的研究

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

小结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢