NDRG2调控结直肠癌细胞增殖的机制研究及其肠道特异性Ndrg2基因敲除小鼠的建立

摘要

人源N-Myc downstream regulated gene2（NDRG2）基因是我们课题组首先发现并报道的新的抑癌候选基因，广泛表达于脑、心、肝、骨骼肌等分化程度较高的组织中。NDRG2参与调控细胞增殖、分化和凋亡等生理过程。
　　前期的研究表明，NDRG2作为一个抑癌候选基因，在胶质瘤、乳腺癌、肝癌、胃癌、结肠癌等恶性程度较高的肿瘤组织中，以及在多种肿瘤细胞系中低表达或不表达。在MCF7和CaCo2等肿瘤细胞系中过表达NDRG2可以显著抑制肿瘤细胞的增殖。在结肠癌组织中，NDRG2参与调控E-cadherin和TGF-β，调控结直肠癌细胞的增殖和转移。我们的研究也表明，NDRG2在结直肠癌病人的肿瘤组织中的表达丰度与肿瘤的恶性程度和肿瘤分期呈负相关性，同时也与结直肠癌病人的愈后和5年存活率呈正相关。目前为止，对NDRG2功能的认知尚不是十分明确。
　　Hepatocyte Growth Factor（HGF）是一个多功能的细胞生长因子，通过结合c-MET调控下游PI3K/Akt、MEK/ERK、JAK/STAT等信号通路，调节细胞增殖、分化、凋亡和迁移等生理过程，是组织器官发育的重要调控通路。c-MET的高表达或突变激活对于胶质瘤、乳腺癌、结肠癌、肝癌等恶性肿瘤的发生发展和转移都有重要的影响。HGF通过调控MEK/ERK和NF-κB等信号通路促进肺泡Ⅱ型细胞、黑色素瘤和胃癌等肿瘤细胞系的增殖，但在某些肿瘤细胞系（HepG2、Huh7、HT29、HT115等）中，HGF则发挥增殖抑制的功能。这种差异可能与HGF/c-MET信号通路与其他信号通路的交联所导致的。
　　转基因小鼠模型为基因的在体功能研究提供了很好的研究策略。NDRG2对细胞增殖的调控作用已被多项实验所证实，我们通过Villi-Cre和Ndrg2-Loxp基因敲除系统构建了Ndrg2的肠上皮细胞特异性敲除小鼠，初步分析Ndrg2对小鼠的小肠和结肠发育的影响，并从动物实验的结果中分析NDRG2可能参与结肠癌发生和发展过程中的分子机制，为下一步研究打下基础。
　　蛋白的翻译后修饰在蛋白功能发挥过程中发挥重要作用，特别是蛋白质的赖氨酸乙酰化修饰广泛参与了蛋白质的降解、转位和分泌等诸多生理过程。我们初步分析了NDRG2的蛋白质序列，结果显示有三个比较保守的赖氨酸位点。我们分别针对这三个位点进行特异性组成型活化的突变（赖氨酸突变为谷氨酰胺）和组成型失活的突变（赖氨酸突变为精氨酸），研究NDRG2蛋白序列中这三个赖氨酸位点的功能。
　　我们的研究表明，NDRG2过表达可以抑制结肠癌细胞的增殖。那么我们推测，在结肠癌细胞系HT29细胞中，NDRG2对细胞增殖的抑制依赖于HGF/c-MET信号
　　通路。同时，我们发现肠道特异性的Ndrg2基因敲除小鼠的小肠和结肠有明显的表型变化，提示Ndrg2可能参与了小鼠肠道发育的调控过程。我们将在下一步工作中，致力于揭示NDRG2调控小鼠小肠和结肠发育过程的分子机制，进一步明确NDRG2的功能。
　　目的；
　　（1）阐明NDRG2调控HGF/c-MET信号通路抑制结肠癌细胞增殖的分子机制。
　　（2）构建Ndrg2肠上皮细胞基因特异敲除小鼠，并分析其表型变化。
　　（3）初步明确NDRG2乙酰化修饰位点及其功能的影响。
　　方法；
　　（1）构建NDRG2过表达稳转细胞株，并以Real-time PCR和Western blot检测NDRG2对HGF、c-MET及其下游分子的影响。
　　（2）构建Ndrg2肠上皮细胞基因特异敲除的转基因小鼠，通过Western blot和免疫组化验证N DRG2的敲除效果，并对基因特异敲除小鼠的表型做初步分析。
　　（3）构建NDRG2特定赖氨酸位点突变的表达载体，明确对NDRG2的乙酰化修饰水平及其功能的影响。
　　结果：
　　（1）NDRG2通过调控HGF/c-MET信号通路，抑制HT29细胞的增殖。HGF激活c-MET和下游分子ERK1/2的磷酸化，上调下游分子p21和p27的表达，从而抑制HT29细胞的增殖。而在HT29细胞中过表达NDRG2可以上调HGF的表达和c-MET的磷酸化水平，并调控下游分子p21和p27的高表达，从而抑制细胞的增殖。
　　（2）NDRG2对C57/BL6小鼠的小肠和结肠的发育的影响。Ndrg2肠上皮细胞基因特异敲除小鼠的小肠和结肠中，NDRG2的敲除效果比较明显，同时，相比于野生型小鼠，Ndrg2基因敲除小鼠的小肠和结肠的长度显著变长。
　　（3）构建NDRG2点突变的突变体的表达载体。构建了NDRG2在K171、K273、K288三个赖氨酸位点的突变体，包括K171R、K273R、K288R三个由赖氨酸（K）突变为精氨酸（R）的突变体，和K171Q、K273Q、K288Q三个由赖氨酸（K）突变为谷氨酰胺（Q）的突变体，并验证了突变体的表达。
　　讨论：
　　NDRG2通过调控HGF/c-MET信号，抑制结肠癌细胞系HT29细胞的增殖；但具体的调控机制还需要进一步研究；NDRG2可以参与小鼠小肠和结肠的发育过程，进而影响小鼠的小肠和结肠的表型变化，但其分子机制尚不明确；NDRG2蛋白的乙酰化修饰对其功能的影响还需要进一步的探索。

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缩略语表

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前言

文献回顾

一、 N DRG2研究现状

二、c-MET研究现状

第一部分 NDRG2调控HGF/c-MET通路抑制结肠癌细胞的增殖

引言

1. 材料

2. 方法

3. 结果

4. 讨论

第二部分 Ndrg2肠道特异性敲除小鼠的鉴定及表型分析

引言

1. 材料

2. 方法

3. 结果

4. 讨论

第三部分 NDRG2蛋白赖氨酸乙酰化修饰功能研究

引言

1. 材料

2. 方法

3. 结果

4. 讨论

小结

参考文献

个人简历与研究成果

致谢