兔耳增生性瘢痕中Th1/Th2细胞相关趋化因子表达及咪喹莫特对其表达影响的研究

摘要

增生性瘢痕是整形外科常见疾病,常伴有外形损毁、红肿瘙痒和疼痛,影响患者身心健康。目前增生性瘢痕发病机制尚不清楚,治疗方法上也是多种多样,但至今尚无有效防治增生性瘢痕的针对性方案来解决患者痛苦。已有研究证实免疫因素在瘢痕的形成与发展过程中占有不可忽视的地位。其中T淋巴细胞群是机体免疫系统中的重要群体,是瘢痕增生过程中的主要免疫细胞。其主要亚群Th1和Th2细胞与瘢痕的纤维化形成有着密切关系。Th1细胞有减轻纤维化的作用[3],而Th2细胞则具有强促纤维化作用。研究表明局部组织产生的趋化因子在Th1、Th2细胞向反应部位募集、浸润的过程中发挥了重要作用。咪喹莫特(imiquimod)是一种临床用于治疗皮肤病的新型免疫调节剂,有研究表明其具有调节T淋巴细胞表达抑制瘢痕增生的作用。本实验从趋化因子角度入手,研究在增生性瘢痕形成过程中Th1/Th2细胞相关趋化因子的表达变化及给予咪喹莫特治疗后的表达变化,进一步探索增生性瘢痕发病机制及咪喹莫特的可能作用机制。实验分两部分:
　　第一部分:兔耳增生性瘢痕中Th1/Th2细胞相关趋化因子的表达及意义
　　目的：研究在兔耳增生性瘢痕的形成过程中Th1/Th2细胞相关趋化因子的动态表达。
　　方法：16只新西兰大耳白兔,建立兔耳增生性瘢痕模型及兔背部正常性瘢痕模型。在第0天及术后第21、28、35、42、49、56、63天每次处死2只并取材,标本行苏木素-伊红(hematoxylin-eosin staining,HE)染色,瘢痕增生指数(Scar elevation index,SEI)测量,Real-time PCR检测Th1/Th2细胞相关12种趋化因子CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL7、CCL13、CCL14、CCL19、CCL21、CX3CL1在两种瘢痕形成过程中的表达。
　　结果：HE染色镜下可见兔耳增生性瘢痕类似人增生性瘢痕结构、兔背部正常性瘢痕类似人正常性瘢痕结构表现。SEI显示兔耳增生性瘢痕组于术后第28天增生程度达到高峰值。Real-time PCR结果显示共有2个趋化因子(CXCL10、CXCL12)在形成正常性瘢痕过程中存在高表达,而在形成增生性瘢痕过程中基本无表达(*P<0.05);共有7个趋化因子(CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL7、CCL13、CX3CL1)在形成正常瘢痕中基本无表达,而在形成增生性瘢痕过程中存在长时间表达。其中CCL2、CCL4、CCL5、CX3CL1这4个趋化因子在增生性瘢痕的形成过程中始终维持着一个长期高表达水平(**P<0.01);还有3个趋化因子(CCL14、CCL19、CCL21)在正常性瘢痕形成中基本无表达,在增生性瘢痕形成过程中仅在增生高峰期内有短暂低水平表达(*P<0.05)。
　　结论：在兔耳增生性瘢痕形成过程中存在Th1/Th2细胞相关趋化因子在种类、量及表达维持时间上的差异性。局部组织中 Th1细胞相关趋化因子CXCL10、CXCL12的低表达,Th2细胞相关趋化因子CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL7、CCL13、CX3CL1的长期性表达,尤其是CCL2、CCL4、CCL5、CX3CL1存在高表达,导致了Th1、Th2细胞在局部的差异性募集,呈现Th2极向化,引发一系列纤维化级联反应,最终导致了增生性瘢痕的病理性改变。本实验长期且连续性地检测了在兔耳增生性瘢痕形成过程中12种趋化因子的动态表达情况,并分析出这些趋化因子表达的趋势,从趋化因子角度进一步阐述了病理性瘢痕的可能发病机制。
　　第二部分:咪喹莫特调节Th1/Th2细胞相关趋化因子的表达抑制兔耳瘢痕增生
　　目的：研究免疫调节剂咪喹莫特是否具有抑制兔耳瘢痕增生的作用及其对兔耳增生性瘢痕形成过程中Th1/Th2细胞相关12种趋化因子表达的影响及意义。
　　方法：16只新西兰大耳白兔,建立兔耳腹侧增生性瘢痕模型。右耳设为咪喹莫特用药组,左耳为空白对照组。术后第14天起,每日给药1次,用药1月。术后第21、28、35、42、49、56、63天处死取材,行HE、Masson染色,测量SEI,行Real-time PCR检测CXCL10、CXCL12、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL7、CCL13、CCL14、CCL19、CCL21、CX3CL1在两组中的表达。
　　结果：HE染色可见咪喹莫特组真皮层增生程度较空白对照组明显减轻。Masso n染色可见咪喹莫特组胶原沉积较空白对照组明显减少。SEI结果显示咪喹莫特能够抑制兔耳瘢痕增生(*P<0.05);PCR结果显示:与空白对照组相比,咪喹莫特组 Th1细胞相关趋化因子CXCL10、CXCL12的表达显著提高(*P<0.05);Th2细胞相关趋化因子CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL7、CCL13、CX3CL1的表达明显下调,尤其CCL2、CX3CL1的表达被明显抑制,在瘢痕增生过程中几乎无表达(*P<0.05)。
　　结论:免疫调节剂咪喹莫特可以上调 Th1细胞相关趋化因子的表达水平,并抑制Th2细胞相关趋化因子的表达,使反应呈Th1细胞极向化来发挥抑制兔耳瘢痕增生的作用。本实验提示我们可以通过调节机体免疫途径中重要的Th1/Th2细胞相关趋化因子的表达水平来干预T淋巴细胞的趋化和活化从而达到防治瘢痕的作用。
　　本实验希望为增生性瘢痕形成机制提供新的理论解释以及为防治增生性瘢痕提供新的治疗靶点。

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缩略语表

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前言

文献回顾

1 病理性瘢痕中存在炎症微环境

2T淋巴细胞在病理性瘢痕形成中发挥重要作用

3 辅助性T淋巴细胞（Th1、Th2）在病理性瘢痕形成中的作用

4 Th1、Th2细胞平衡与失衡

5 趋化因子与趋化因子受体

6 趋化因子对Th1/Th2免疫平衡的影响

7 与Th1/Th2细胞趋化相关的几种重要的趋化因子

8 干预T淋巴细胞的趋化和活化的治疗模式：

9 增生性瘢痕模型研究的现状

正文

实验一 兔耳增生性瘢痕中Th1/Th2细胞相关趋化因子的表达及意义

引言

1 材料

2 实验方法

3 结果

4 讨论

实验二 咪喹莫特调节Th1/Th2细胞相关趋化因子表达抑制兔耳瘢痕增生

引言

1 材料

2实验方法

3 结果

4 讨论

小结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢