中国明对虾生殖系统发育的组织学观察及foxl2基因的克隆

摘要

中国明对虾（Fenneropenaeus chinensis）属于甲壳纲、软甲亚纲、十足目、对虾科、明虾属，是中国的传统水产养殖虾类之一。本文采用组织学方法系统地研究了中国明对虾外生殖器官的形态变化以及精巢和卵巢发生及分化的时间顺序。同时利用同源克隆和RACE技术，获得中国明对虾卵巢分化标志基因——foxl2的cDNA序列，为进一步确认性别分化时间奠定基础。该研究既完善了中国明对虾繁殖生物学的相关内容，也为开展甲壳类动物的性别调控、单性养殖和遗传育种提供了理论依据。 1、中国明对虾外生殖器官的发生 本文首先观察了中国明对虾外生殖器官的形态发生和发育过程。形态学观察显示:仔虾后16天时观察到外生殖器官的形态出现分化。在仔虾后16天时，仔虾的第四与第五步足之间腹甲处的锥突开始下陷，锥突基部在第五步足之间腹甲上的着生范围变大，可以初步判断其为雌虾。相反，后16天仔虾的第四与第五步足之间的腹甲的锥突开始隆起的，可以判断为雄虾。 仔虾后54天时，通过雌虾的纳精囊和雄虾的交接器可以明显辨别雌雄个体。后54天雌虾的第四与第五步足之间的腹甲面积继续变宽，且在第五步足之间腹甲的后缘出现微小的瓣膜，此瓣膜是雌性生殖系统中纳精囊的组成部分。此时，后54天雄虾的第一泳足的内肢基部开始变宽，形成交接器的雏形。 仔虾后72天以后，主要是雌虾纳精囊和雄虾交接器的生长时期。P80天雌虾的第四步足腹甲后缘中间开始向后延伸，腹甲后缘向后延伸形成“山”字形突起，为纳精囊前端。在P112天纳精囊基本形成，两侧的瓣膜覆盖第五步足之间腹甲的1/3。P124天第四步足之间的腹甲的“山”字形结构两侧突出明显，纳精囊两侧的瓣膜覆盖第五步足之间腹甲的1/2。P72天雄虾的第一泳足内肢的基部继续变宽，在P92天时，雄虾第一泳足内肢的基部明显增宽，表面外侧沟回比较明显;在P106-P124天时，第一泳足内肢继续生长，交接器外缘沟回加深，外缘开始翻卷，此时交接器基本形成。 2、性腺的发生与分化 实验仔虾，经过固定、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片和苏木精与伊红染色等过程，用于观察性腺的发育过程。实验结果显示:精巢和卵巢的发生与仔虾的发育时期有密切的关系。 仔虾后15天，从外生殖器官的形态上尚不能辨别雌雄，此时的性腺原基是由几个生殖细胞组成，生殖细胞椭圆形。随着发育的进行，仔虾后16天时，雌虾与雄虾的外生殖器官的形态出现差异，而性腺没有发生明显的变化。P25天雌虾卵巢中生殖细胞数目增多，体积增大并逐渐聚集成簇，细胞形状不规则。P44天时，卵巢中生殖细胞数量和体积有明显增大，生殖细胞卵圆形，细胞簇外边由一层扁平细胞组成的膜包被，预示卵巢的初步形成。仔虾后60天时，卵巢中细胞簇间的间距变大，分散明显，为滤泡腔的形成做准备。仔虾P74-P86天时，卵巢壁加厚，滤泡腔明显，生殖细胞开始分化，细胞核椭圆形，核仁不明显，染色质小而分散，呈颗粒状。卵圆形的卵原细胞出现。仔虾后124天，卵巢体积明显增大，滤泡腔数目增多，生殖细胞的分化速度加快。 仔虾后30天雄虾精巢中生殖细胞数目继续增加，体积继续变大，椭圆形的生殖细胞紧密排列。仔虾后40天时，随着生殖细胞数目和体积的继续增多，精巢向两侧延生。仔虾后60天时，精巢体积增大，开始沿着肝胰脏向身体两侧生长。仔虾后70天时，滤泡腔的雏形出现。随着精巢体积不断增大，精巢内生殖细胞也开始分化，仔虾后86天时，精巢内精原细胞开始分化。仔虾后92天时，精巢的9个中小叶全部形成，在仔虾后115天时，滤泡腔内可以观察到精原细胞和初级精母细胞。 3、促雄性腺和精英囊的发育 精荚囊由输精管末端发育而来，在雄虾P30天的平切面上能观察到输精管，位于第五步足的肌肉之间。P50天观察到精荚囊，其横切面为椭圆形，外有肌肉组织包被，紧邻腹血管。仔虾后100天时，精荚囊结构清晰，精荚囊内壁形成许多褶皱，有一个大腔和一个小腔。 在精英囊外侧壁上，通过结缔组织与末端输精管外侧相连处，观察到促雄性腺。仔虾后80天时，促雄性腺呈团状，其细胞卵圆形分布在肌肉组织中，细胞核大，细胞核被染成深蓝色，核仁很难辨认。在仔虾后100天时，促雄性腺整体结构为片状，呈现中间宽两头窄的形状。 4、卵巢发育基因foxl2 cDNA的克隆 将哺乳动物、鸟类、爬行动物、两栖动物、鱼类、节肢动物、软体动物中foxl2基因的氨基酸序列和核苷酸序列进行比对，设计兼并引物，并进行PCR扩增。获得的中国明对虾foxl2基因的cDNA片段长262bp，编码87个氨基酸。序列比对和系统进化分析显示，该片段的氨基酸序列与人、短吻鳄、牡蛎聚为一类，且相似性较高，皆为72％。

目录

声明

摘要

引言

第一章 综述

1 软甲亚纲主要物种的形态特征

2 软甲亚纲动物生殖系统发育的研究进展

2．1 雌性生殖系统的发育

2．2 雄性生殖系统的发育

3 软甲亚纲性别决定机制与卵巢分化相关基因的研究进展

3．1 性别决定机制

3．2 卵巢分化相关基因

4 Foxl2基因的研究进展

4．1 Foxl2基因的序列特征

4．2 Foxl2基因在性别分化和卵巢发育中的作用

5 本研究的目的意义

第二章 中国明对虾生殖系统发育的组织学观察

1 材料与方法

1．1 实验材料

1．2 实验方法

2 实验结果

2．1 雌虾外生殖器官的发育

2．2 雌虾内生殖器官的发育

2．3 雄虾外生殖器官的发育

2．4 雄虾内生殖器官的发育

3 讨论

3．1 卵巢发育与外生殖器官性征的相关性

3．2 精巢发育与外生殖器官性征的相关性

3．3 精巢与卵巢发育的时间关系

3．4 促雄性腺与精巢发育的时间关系

第三章 中国明对虾foxl2基因的克隆

1 材料与方法

1．1 实验材料

1．2 实验方法

2 实验结果

2．1 中国明对虾卵巢组织总RNA质量检测

2．2 阳性克隆的筛选

2．3 Foxl2基因的cDNA序列和其编码氨基酸分析

3 讨论

参考文献

致谢