七氟醚通过诱导内质网应激对幼年大鼠海马不同亚区的不同损伤作用

摘要

目的：
　　七氟醚是一种经典的吸入性麻醉药，近年来由于其具有起效快，易复苏以及麻醉深度易调控等特点，七氟醚被广泛应用于临床手术麻醉。而且在老年人、中青年人以及儿童等各年龄段患者中均可适用，尤其在儿童全麻诱导及维持中有显著优点，因此儿童成为其重要的适用群体。
　　但是，众所周知，到目前为止无论是静脉麻醉药还是吸入性麻醉药，其作用机制都尚不明了。对于这样一种作用于中枢神经系统的药物，在方便手术操作的同时，他的安全性越来越成为人们关注的焦点，特别是对幼年儿童的神经发育是否有不利影响更是成为医疗工作者亟待解决的一个问题。早期对于吸入性麻醉药的研究主要集中在其对神经系统的保护作用上，有研究表明，七氟醚能够促进大鼠脑缺血区的细胞存活，而且能够减轻大脑再灌注损伤。还有学者认为，七氟醚预处理能够减轻缺血缺氧对大鼠大脑的损害。这些都为七氟醚的临床应用安全性提供了支持。但是，已经有越来越多的研究逐渐证实，七氟醚等吸入性麻醉药存在一定程度的神经毒性，并且对儿童认知能力的发育有着不可忽视的影响。大量研究证实，七氟醚等吸入性麻醉药能够诱导小鼠大脑皮层及海马等众多脑区发生细胞凋亡，更重要的是，如果将幼年大鼠暴露于七氟醚后，其成年后的空间认知能力明显低于正常小鼠。然而，吸入性麻醉药造成神经毒性的机制到目前为止也尚不明了。
　　有研究表明，吸入性麻醉药神经毒性的产生可能与其过度激活了γ氨基丁酸A型受体受体（GABAR）有关。最近有人提出内质网应激可能也是其神经毒性的重要机制之一。内质网是细胞内一种重要的细胞器，他对细胞的存活、蛋白合成、胞内钙平衡等众多生理过程起着调节作用。一旦其功能紊乱会引发诸多疾病。当缺氧、钙失衡、毒物刺激等损伤因素作用于细胞后，会诱发内质网应激，从而引起错误折叠的蛋白质在细胞内累积及钙超载，最终引起细胞生理功能紊乱甚至凋亡。虽然之前的研究发现内质网应激可能与七氟醚引起的大脑细胞凋亡有关，然而经历七氟醚暴露的幼年大鼠海马是否也会发生内质网应激？七氟醚引起的内质网应激在大鼠海马不同类型的细胞中是否会造成不同的损伤？根据这一理论是否可以研究出一种预防七氟醚神经毒性的策略呢？因此，本课题围绕上述这一系列问题展开了研究，目的是进一步探讨内质网应激在七氟醚对幼年大鼠海马的损伤中作用，以及探讨通过抑制麻醉过程中的内质网应激对大鼠神经系统的保护作用。
　　方法：
　　本实验主要由三个部分组成，第一部分首先用七氟醚处理小鼠海马神经元来源的HT22细胞系，通过蛋白免疫印迹技术检测细胞中BiP、p-IRE1等内质网应激标记蛋白及内质网凋亡途径标记蛋白caspase-12水平的变化，再利用流式细胞技术检测处理后细胞凋亡率。第二部分是将3周龄大鼠暴露于七氟醚，通过蛋白免疫印迹技术检测BiP、p-PERK等蛋白及caspase-12在海马组织中的表达水平，再运用TUNEL染色法观察其海马脑片中凋亡细胞的分布，并利用免疫组织化学荧光双标法检测凋亡细胞的性质。之后取七氟醚暴露后的大鼠海马脑片利用膜片钳技术检测海马CA1区椎体神经元的内在兴奋性变化，并在原代培养的大鼠海马细胞中做钙离子探针标记，观察细胞内游离钙离子浓度的变化。第三部分是在大鼠麻醉前给予腹腔注射4-PBA抑制内质网应激，待5周后其生长到成年期做水迷宫测试，观察抑制内质网应激对大鼠认知能力的保护作用。
　　结果：
　　实验一：七氟醚暴露引起HT22细胞发生内质网应激的研究
　　（1）将细胞分为3组，对照组、处理组以及加内质网应激抑制剂4-PBA组，在麻醉诱导箱中以2 vol％七氟醚处理5小时后收集细胞蛋白进行蛋白免疫印记检测。结果显示，处理组细胞中BiP、p-IRE1以及活化的caspase-12水平比其余两组均有显著升高。4-PBA能显著降低七氟醚引起的内质网应激水平,Р<0.01。
　　（2）各组细胞进行七氟醚处理后立即收集细胞，利用流式细胞技术进行细胞凋亡的检测。结果显示，处理组的细胞凋亡率可高达9.4±0.13%，比对照组的1.52±0.60%显著增高，而加4-PBA组凋亡率为3.93±0.42%。这证明抑制内质网应激可有效减少七氟醚引起的海马细胞凋亡。
　　实验二：七氟醚对幼年大鼠海马不同亚区的影响
　　（1）将三周龄的幼年SD大鼠随机分为对照组、处理组以及加内质网应激抑制剂4-PBA组。在麻醉诱导箱中以2 vol%七氟醚处理5小时并复苏2小时后收取大脑海马组织蛋白样品以及灌注切脑片。海马组织蛋白样品进行蛋白免疫印记检测。结果显示，处理组样品中BiP、p-PERK以及活化的caspase-12水平比对照组有显著升高，而加4-PBA后，这几个蛋白水平均有所下降Р<0.01。
　　（2）各组大鼠海马脑片进行TUNEL染色，发现处理组有明显的细胞凋亡现象，而且凋亡细胞主要集中在齿状回区，CA1-CA3区几乎无细胞凋亡，加4-PBA组的凋亡细胞数明显低于处理组。
　　（3）各组大鼠海马脑片进行活化的caspase-12与NeuN免疫荧光双标染色，结果显示二者基本重合，且活化的caspase-12的表达变化与蛋白免疫印记结果相一致，证明七氟醚处理后主要是神经元发生了内质网应激，而非胶质细胞。
　　（4）各组大鼠海马脑片进行TUNEL与Ki67免疫荧光双标，结果显示齿状回区的凋亡细胞中有部分与Ki67阳性细胞相重合，证明七氟醚诱导的凋亡细胞中有部分未分化成熟的神经干细胞。
　　（5）3周龄大鼠如上述分组并处理后取新鲜海马脑片进行膜片钳电生理记录，检测海马CA1区锥体神经元的内在兴奋性。结果显示处理组中CA1区锥体神经元的平均放电个数和放点频率均显著降低，加4-PBA组这些数据却明显回升。证明七氟醚使海马CA1区锥体神经元的内在兴奋性显著降低了。
　　（6）原代培养除齿状回以外的海马神经元，培养一周后如上述进行七氟醚处理，然后在无钙缓冲液中做Fluo-3钙离子探针染色，实验发现，处理组海马神经元内细胞质内钙离子浓度明显高于对照组和加4-PBA组 P<0.01。
　　实验三：幼年期的七氟醚暴露对大鼠成年后认知能力的影响
　　（1）3周龄SD大鼠如上述随机分组并处理，将其正常饲养至2月龄，进行水迷宫空间记忆能力测试，训练四天，结果在四天的训练过程中，各组大鼠找到逃生平台的时间均逐渐减少。而从第三天开始，处理组大鼠的逃脱时间明显长于其余两组。
　　（2）训练4天后，第五天进行水迷空间探索实验，结果无论是在目标象限停留时间还是穿越平台区的次数，处理组均低于其余两组。加4-PBA组与对照组之间无显著性差异。
　　结论：
　　本实验证明了七氟醚能够通过诱导内质网应激对海马神经元造成毒性损伤，其创新点在于发现这种损伤作用在海马不同亚区所引起的结果是不同的，而且如在七氟醚麻醉前给予4-PBA抑制内质网应激可有效降低这种损伤作用并缓解其造成的成年后认知能力受损。这进一步阐明了七氟醚神经毒性的重要机制，并对临床防治这一副作用起到了指导作用。
　　（1）离体和在体实验均证明七氟醚可诱导海马神经元发生内质网应激。
　　（2）七氟醚通过诱导内质网应激造成海马齿状回发生细胞凋亡，而在CA1-CA3却无细胞凋亡现象。
　　（3）七氟醚暴露引起海马CA1区锥体神经元内在兴奋性的降低，这一作用与内质网应激导致的内质网钙耗竭和胞浆内钙超载相关。
　　（4）幼年期七氟醚暴露可引起成年后认知能力的缺陷，而这一缺陷可被七氟醚暴露前内质网应激抑制剂处理所缓解。

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文献回顾

1. 吸入性麻醉药的发展

2. 吸入性麻醉药对幼年动物神经系统损伤机制的研究

3. 内质网应激

4. 海马CA1锥体神经元内在兴奋性

第一部分 七氟醚暴露引起HT22细胞发生内质网应激的研究

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

第二部分 七氟醚暴露对幼年大鼠海马各亚区的影响

1 材料

2方法

3 结果

4 讨论

第三部分 幼年期七氟醚暴露对大鼠成年后认知能力的影响

1 材料

2 方法

3结果

4 讨论

小结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢