联合应用IL-4MT及sIL-5Rα对哮喘小鼠气道重塑及TGF-β1、Act-A的影响

摘要

支气管哮喘（以下简称为哮喘）是以可逆性的气道阻塞和气道高反应性为主要特征的慢性气道炎症性疾病，是一种常见的严重威胁公众健康的全球性慢性疾患。哮喘的发病率及死亡率呈明显逐年上升趋势，根据世界卫生组织(World Health Organization，WHO)的估计，到2025年全球哮喘患者的总人数将达4亿人[1]。哮喘患者的特征性临床症状表现是反复发作的喘鸣、气急、胸闷与咳嗽，引起这些临床症状的原因被认为不仅与气道的高反应性（airway hyperresponsiveness，AHR）及气道的炎症有关，而且与气道壁的结构重塑有关[2]。气道重塑（Airway remodeling）是固定性气流受限和肺功能受损的主要病理基础，与气道的高反应性和气道的阻塞密切相关，可导致患者的劳动力丧失，并增加社会医疗负担。
　　对哮喘发病及气道重塑机制的研究一直是学者关注的热点。目前，比较公认气道炎症是哮喘重要的发病机制，并与气道重塑密切相关。以气道炎症为基础的抗炎治疗是近年哮喘治疗的重大突破，而长期的临床实践亦证明了其有效性。但即使用最佳的抗炎治疗仍有部分哮喘患者病情反复恶化，迁延不愈。有学者提出气道重塑在哮喘的初期就已经参与其中，气道炎症与气道重塑可能是两个平行且独立的病理过程，而不是以往认为的序贯过程[3]。研究表明Th2细胞在哮喘的气道炎症的发生、发展过程中发挥着重要作用。另外，多种细胞因子与其受体共同参与了哮喘的发病及气道重塑的过程，对哮喘的启动、维持、放大效应和气道的重塑过程也起着不可替代的作用。易感个体在吸入或接触到环境中的变应原后，Th2细胞介导其变态反应并分泌IL-4，IL-5，IL-13等细胞因子，作用于淋巴细胞、肥大细胞，嗜酸性粒细胞，嗜碱性粒细胞等，从而引起哮喘患者的气道炎症。同时这些介质可引起气道上皮的损伤，杯状细胞的增殖，成纤维细胞分化、增殖，平滑肌细胞的迁移和增殖，导致气道重塑的发生。其中一些参与气道重塑的介质目前已经确定，纤维化细胞因子如转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）、Th2细胞因子如IL-4，IL-5，IL-13等[4]。TGF-β1与Act-A(activin-A)均是TGF-β超家族的成员，已经有研发现两者与哮喘的气道重塑关系密切[5,6]。本研究通过联合应用 IL-4突变体（IL-4MT）及 IL-5可溶性受体α（sIL-5Rα）对哮喘小鼠模型进行干预，阻断与气道重塑相关的促炎因子 IL-4、IL-5及IL-13的作用，观察其对小鼠的气道重塑及TGF-β1、Act-A水平的影响，对其作用机理进行初步探讨。
　　目的：
　　本研究主要是应用IL-4突变体和IL-5可溶性受体α对哮喘小鼠模型进行干预，观察两者对哮喘小鼠的气道重塑及TGF-β1、Act-A水平的影响，探讨其对哮喘气道重塑的治疗与控制意义。
　　方法：
　　1.50只BALB/c雌性小鼠按随机数字表分为5组：对照组、哮喘组、IL-4MT治疗组、sIL-5Rα治疗组、联合IL-4MT及sIL-5Rα治疗组（简称为联合治疗组）。对哮喘组与各治疗组分别给予卵蛋白（OVA）致敏和激发。其中，各治疗组（IL-4MT治疗组、sIL-5Rα治疗组、联合治疗组）分别在激发前30分钟腹腔注射 IL-4MT100μg、sIL-5Rα100μg及IL-4MT、sIL-5Rα各100μg进行靶向干预，对照组与哮喘组用生理盐水代替。
　　2.末次激发24小时后收集小鼠支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）、血清及肺组织。用ELISA法检测各组小鼠BALF及血清中TGF-β1、Act-A的水平，实时荧光定量PCR检测TGF-β1、Act-A在肺组织中mRNA的表达水平，HE染色观察各组小鼠气道结构的变化，并利用专业医学图像分析软件测量支气管周径（Pbm）、支气管管壁厚度(WAt/Pbm)、支气管平滑肌厚度(WAm/Pbm)。
　　结果：
　　1.与对照组比较，哮喘组小鼠BALF及血清中的TGF-β1、Act-A水平显著升高[(162.51±23.12)pg/ml vs(76.94±10.73)pg/ml，(1130.21±79.94)pg/ml vs(489.74±40.32) pg/ml；(863.98±54.78)pg/ml vs(272.87±21.98)pg/ml，(1341.43±69.94)pg/ml vs(550.17±50.86)pg/ml，P值均<0.01]；与哮喘组比较，IL-4MT治疗组[分别为(135.88±13.54) pg/ml，(934.90±53.41)pg/ml；(597.53±49.97)pg/ml，(1076.50±56.33)pg/ml]、sIL-5Rα治疗组[分别为(110.76±16.40)pg/ml，(862.35±49.52)pg/ml；(656.09±41.95)pg/ml，(1158.21±73.12)pg/ml] BALF及血清中的TGF-β1、Act-A水平均明显下降（P值均<0.01）；与单独治疗组相比，联合治疗组BALF及血清中的TGF-β1、Act-A水平下降地更明显[分别为(95.94±9.86)pg/ml，(685.33±50.86)pg/ml；(512.76±36.15)pg/ml，(794.56±50.46) pg/ml，P值均<0.05]。
　　2.与对照组比较，哮喘组小鼠肺组织中的TGF-β1及Act-A mRNA的表达水平明显升高（其倍数改变分别3.44±0.72；4.45±0.54，P值均<0.01）。与哮喘组比较，IL-4MT治疗组与sIL-5Rα疗组小鼠肺组织中的TGF-β1及Act-A mRNA的表达水平稍下降（其倍数改变分别为2.73±0.21，2.54±0.36；3.03±0.33，3.35±0.29，P值均<0.05）；与单独治疗组相比，联合治疗组肺组织中的TGF-β1及Act-A mRNA的表达水平下降地更明显（其倍数改变分别2.06±0.28；1.93±0.30，P值均<0.01）。
　　3.(1)光镜下可观察到与对照组相比，哮喘组的支气管管周炎症细胞浸润、杯状细胞增生、支气管壁增厚明显；而与哮喘组比较，各治疗组的上述改变较轻；与单独治疗组相比，联合治疗组的上述改变减轻更明显。
　　(2)与对照组小鼠的支气管周径Pbm(444.49±54.26)μm相比，哮喘组与各治疗组的 Pbm分别为(458.26±54.79)μm，(478.50±71.25)μm，(470.00±58.24)μm，(451.64±72.14)μm（P值均>0.05），无统计学差异。与对照组小鼠的支气管总管壁厚度WAt/Pbm(15.99±2.17)μm2/μm相比，哮喘组小鼠的WAt/Pbm为(20.77±2.23)μm2/μm（P值<0.01），具有统计学差异；与哮喘组比较，IL-4MT治疗组、sIL-5Rα治疗组的WAt/pbm为(18.95±1.11)μm2/μm，(18.49±1.15)μm2/μm，差异具有统计学意义（P值均<0.05）；与单独治疗组相比，联合治疗组小鼠的WAt/Pbm为(17.03±0.74)μm2/μm，差异具有统计学意义（P值<0.01），提示联合治疗的效果更好。与对照组小鼠的平滑肌厚度WAm/Pbm(3.79±0.67)μm2/μm相比，哮喘组与各治疗组WAm/Pbm的差异无统计学意义，[分别为(4.47±0.74)μm2/μm，(4.41±1.90)μm2/μm，(4.09±0.40)μm2/μm，(4.04±1.03)μm2/μm，P值均>0.05]。
　　结论：
　　联合应用 IL-4MT及 sIL-5Rα对哮喘小鼠模型进行干预，可明显降低哮喘小鼠TGF-β1、Act-A及其mRNA的表达水平，并可减轻支气管的管壁总厚度，在减轻哮喘小鼠气道重塑方面发挥了一定的作用，表明联合应用IL-4MT及sIL-5Rα可减轻哮喘的气道重塑，为治疗哮喘提供了新的的治疗策略。

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声明

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缩略语表

中文摘要

英文摘要

前言

文献回顾

一、哮喘概述

二、气道重塑概述

三、IL-4与哮喘

四、IL-5与哮喘

五、TGF-β1、Act-A与哮喘

1 材料

1.1 主要仪器

1.2 主要试剂

1.3实验动物

1.4主要溶液配制

1.5引物设计

2 方法

2.1 实验动物分组

2.2哮喘模型的制备

2.3哮喘模型的干预处理

2.4标本的收集与处理

2.5 ELISA 检测血清及BALF中TGF-β1的水平

2.6 ELISA 检测血清及BALF中Act-A的水平

2.5实时RT-PCR实验

2.7苏木素-伊红染色（HE染色）

2.8图像分析

2.7统计学分析

3 结果

3.1各组小鼠的症状观察

3.2 BALF及血清中TGF-β1的水平

3.3 BALF及血清中ACT-A的水平

3.4 TGF-β1、ACT-A mRAN在肺组织中的表达

3.5 肺组织病理学改变

3.6气道形态学测定图像分析

4 讨论

小结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢