脉冲电磁场对低弹多孔钛合金的生物协同效应研究

摘要

背景：
　　多孔钛合金与实体钛合金相比能够改善植入物的骨整合，是近年金属植入物研究热点。但是多孔钛合金（Ti-6Al-4V）孔隙结构内部骨长入不是十分理想，特别是体积较大多孔材料中心骨长入较少。经过前期的研究，我们分析骨长入不佳的可能原因为：1、多孔结构的采用仅能降低钛合金部件表观弹性模量，而材料本身力学性能没有实质变化，与骨组织微观力学性能不匹配依然存在；2、正常骨组织具有压电效应，其力-电转换特性可将外界应力刺激转换为内部电磁信号，电信号对于骨修复与改建至关重要，而植入部位由于正常骨组织的缺失，无法产生骨修复所需的相应电磁信号。
　　为解决上述问题，本研究采用电子束熔融（Electron beam melting，EBM）技术，以新型低弹性模量 Ti-24Nb-4Zr-7.9Sn（Ti2448）合金粉末制备新型低弹性模量多孔钛合金；同时，引入外源性脉冲电磁场（Pulsed Electromagnetic Fields，PEMF）进行干预，模拟正常骨组织产生的内源性电磁信号。课题组前期研究已证实了PEMF可加强成骨细胞与钛合金（Ti-6Al-4V）表面的生物兼容性。然而，PEMF和新型低弹性模量多孔钛合金协同的生物学效应尚未见报道。因此，本研究通过体外细胞实验和动物体内埋植实验，验证PEMF与低弹性模量多孔钛合金的协同生物学作用。
　　目的：
　　1、评价PEMF对多孔Ti2448材料表面成骨细胞活性的影响；
　　2、评价PEMF对动物体内多孔Ti2448植入物的骨长入和骨整合的作用效果。方法
　　1、多孔 Ti2448材料的制备：沿用课题组前期研究的多孔参数，在Materialise软件中设计多孔钛合金三维模型，将模型数据导入 EBM设备，以新型低弹钛合金Ti2448粉末为原料制备两种外部规格的多孔Ti2448材料，采用扫描电子显微镜检测材料表面形态和元素组成；
　　2、PEMF平台的搭建：PEMF平台由PEMF发生器和线圈组成。PEMF发生器使用GHY-Ⅲ型；线圈则分为两种，细胞实验用线圈为HelmHolz双线圈，动物实验用线圈为改进型HelmHolz三线圈以获得更大范围的均匀电磁场。将线圈与电磁场发生器连接并通电，待电流稳定后使用高斯计检测线圈内部和中心区域的磁感强度，以及周围环境的磁感强度。
　　3、体外细胞实验：小鼠成骨前体细胞 MC3T3-E1接种于多孔 Ti2448片表面，每日进行PEMF暴露2h，与未暴露PEMF的多孔Ti2448片表面细胞进行比较，在暴露后1天、4天、7天等不同时间点通过细胞增殖、扫描电子显微镜、活死细胞荧光染色、实时定量PCR等细胞学检测手段进行分析。
　　4、动物体内试验：24只雌性成年新西兰兔随机分为2组，双侧股骨外侧髁部植入多孔Ti2448棒，一组进行PEMF暴露2h/日，一组无PEMF暴露，术后4周、12周取材行荧光观察、Van Gieson染色检测等。
　　结果：
　　制备的多孔Ti2448材料为规则疏松多孔结构，孔径710±42μm，孔隙率68±5.3％，多孔钛片直径12 mm×高度3 mm，多孔钛棒直径6 mm×高度10 mm，表面形态粗糙。
　　成功搭建用于细胞实验和动物实验的脉冲电磁场发生平台，经检测，线圈内部磁感强度为2 mT，周围环境磁感强度为0.05±0.002 mT。
　　细胞增殖实验中脉冲电磁场刺激后第1天没有明显差别，第4天、第7天实验组（PEMF）细胞数均高于对照组（p<0.01）；活死细胞荧光染色发现两组多孔Ti2448片表面大多数为活细胞绿色荧光，死细胞红色荧光相对较少，而实验组与对照组相比可见更多的绿色荧光细胞与细胞群的形成，高倍镜下细胞伪足清晰，细胞状态良好；扫描电镜下也可见明显细胞伪足，细胞状态良好，低倍镜下实验组细胞数量也明显多于对照组；成骨相关基因PCR结果显示，第4天对照组与实验组的碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）和骨形态发生蛋白-2（bone morphogenetic protein，BMP-2）基因表达没有差异，而实验组的1型胶原（type1 collagen，Col-1）、骨钙素（osteocalcin，OCN）、骨桥蛋白（osteopontin，OPN）和runt相关转录因子2（runt-related transcription factor2，Runx2）基因表达量均高于对照组（p<0.05），第7天实验组ALP、Col-1、OCN、Runx2和BMP-2基因表达量均高于对照组（p<0.05），而OPN的表达量没有差异，但已处于较高表达水平。
　　动物实验中新骨（钙盐沉积）荧光标记成线性排列，术后4周和12周，实验组新生骨沉积速率（两种荧光间距）均高于对照组（p<0.05），Van Gieson染色发现，术后4周两组的多孔Ti2448植入材料周围均有散在新生骨组织环绕，新骨与材料之间可见明显缝隙，对照组新骨长入较少且中心部位空洞，实验组有较多新骨长入，中心部位也可见少量不规则新骨长入；术后12周，两组多孔材料内部均有较多的骨长入，实验组与对照组相比，骨长入量则更多，对照组材料与新骨之间还存在少量的间隙，而实验组新骨和材料结合紧密，骨整合良好。新骨量百分比半定量分析显示，术后4周和12周，实验组新生骨面积百分比均高于对照组（p<0.05）。
　　结论：
　　EBM技术制备的多孔 Ti2448植入物表观弹性模量和微观力学性能都能够更好的与骨组织匹配。PEMF在体外能够促进多孔Ti2448材料表面成骨前体细胞的活性，在体内能够加强多孔Ti2448植入物骨长入和骨整合，表明PEMF与多孔Ti2448协同作用效果良好，二者的联合应用具有广阔的临床前景。

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缩略语表

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英文摘要

前言

文献回顾

一、医用钛合金的研发进展

二、脉冲电磁场对成骨的影响研究

三、金属植入物骨整合及脉冲电磁场对其影响的研究进展

四、小结

第一部分 多孔钛合金的设计和制备

1 引言

2 材料与方法

3 结果

4 讨论

第二部分 脉冲电磁场对多孔Ti2448表面MC3T3-E1细胞生物学行为影响研究

1 引言

2 材料与方法

3 结果

4 讨论

第三部分 脉冲电磁场对动物体内多孔Ti2448骨长入的影响研究

1 引言

2 材料和方法

3 结果

4 讨论

小结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢