NRG-1在缺血/再灌注冠脉微血管内皮细胞-心肌细胞之间的作用及其机制

摘要

背景及目的：
　　再灌注治疗是缺血性心脏病发生急性血管堵塞时治疗的关键，然而，再灌注常常并发缺血/再灌注损伤（ischemia/reperfusion injury，I/RI），可加重心肌损伤，导致病情恶化。I/RI的发生发展机制复杂，目前尚未完全阐明。内皮细胞-心肌细胞的相互作用在调节心脏功能中占有重要地位，但其相互作用的机制仍不明确。研究显示，内皮细胞可以促进心肌细胞存活，减少缺氧复氧诱导的心肌细胞损伤。前期研究证实，I/RI的发生与冠状动脉微血管内皮细胞（cardiac microvascular endothelial cells，CMECs）和心肌细胞的凋亡密切相关，我们前期研究显示，胰岛素通过抑制CMECs和心肌细胞的凋亡，从而保护缺血/再灌注心脏。但在此过程中，这两种细胞之间的相互作用有待进一步研究。
　　神经调节蛋白-1（neuregulin-1，NRG-1）是一种表皮生长因子，可以保护心脏并促进心脏发育成熟，主要由内皮细胞合成释放。但在I/RI过程中，CMECs是否能释放N RG-1，释放的NRG-1是否能促进心肌细胞存活，尚未见报道。研究报道，NRG-1可作用于ErbB2受体激活ERK使其发生磷酸化，同时，ERK1/2可调节COX-2表达，对I/RI的心肌起保护作用。然而，在CMECs-心肌细胞共培养时，ERK是否在NRG-1保护缺血/再灌注心肌中起重要作用，以及ERK与COX-2是否有关联仍不明确。因此，本实验通过建立CMECs-心肌细胞相互作用的实验模型，并模拟缺血/再灌注损伤（simulated ischemia reperfusion，SI/R），观察I/RI是否刺激CMECs释放NRG-1，NRG-1是否可以保护缺血/再灌注心肌，并初步探讨其发生机制。
　　方法：
　　1.分离培养大鼠冠脉微血管内皮细胞和心肌细胞，建立模拟缺血/再灌注模型和CMECs-心肌细胞共培养实验模型。根据研究对象的不同，CMECs随机分为对照组，SI/R组和SI/R+Ins（10-7mol/L）组，并分别收集各组的培养上清。而心肌细胞随机分为以下7组：对照组，SI/R组，SI/R+Coculture（共培养）组，SI/R+Coculture+anti-ErbB2（ErbB2抑制剂）组，SI/R+NRG-1组，SI/R+NRG-1+anti-ErbB2组，SI/R+NRG-1+PD（ERK1/2抑制剂PD98059）组。
　　2.心肌细胞的活性和凋亡指数分别用 MTT法和TUNEL法检测进行检测，Western blot法检测CMECs培养上清中NRG-1表达、心肌细胞ErbB2、ERK和COX-2蛋白或磷酸化水平，Caspase-3酶活性反应心肌细胞凋亡。
　　结果：
　　1.成功分离培养CMECs和心肌细胞，并建立了SI/R模型和CMECs-心肌细胞共培养模型。
　　2.SI/R（4h/4h）组的心肌细胞活性比对照组明显降低（P<0.01），而SI/R+Coculture组细胞活性较SI/R组升高（P=0.02）。CMECs进行SI/R（4h/4h）处理后，诱导NRG-1的释放（2.96±0.30），当给予胰岛素时，NRG-1升高更显著（4.62±0.26）（均为P<0.01）。检测SI/R不同时间的NRG-1分泌量，4h/4h时分泌量较对照组增加最显著（P<0.01）。心肌细胞SI/R组凋亡指数和Casp ase-3酶活性比对照组明显升高（27.97±0.90比3.58±0.23，P<0.01；375.93±11.76比100.00±0.00，P<0.01）。共培养或NRG-1处理细胞后，凋亡指数和Caspase-3酶活性较SI/R组降低（16.82±1.03比27.97±0.90，P<0.01；166.16±15.15比375.93±11.76，P<0.01），且ErbB2和ERK磷酸化水平以及COX-2表达明显增加（均为P<0.01）。用ErbB2或ERK1/2抑制剂预处理心肌细胞后，共培养和NRG-1的作用消失（均为P<0.01）。
　　结论：I/RI时CMECs可以释放NRG-1，诱导心肌细胞ErbB2磷酸化，激活下游ERK信号通路，上调COX-2表达，从而抑制I/RI诱导的心肌细胞凋亡。

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缩略语表

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前言

文献回顾

一．冠心病的概述

二．心肌缺血/再灌注损伤

三．冠状动脉微血管内皮细胞

四．内皮细胞和心肌细胞的相互作用

五．胰岛素

六．神经调节蛋白-1及其受体E rbB

七．N R G-1/E rbB信号的功能

八．COX-2

第一部分 培养细胞并建立模拟缺血/再灌注模型以及CM EC s-心肌细胞共培养模型

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

第二部分 CM EC s释放的NR G-1对S I/R诱导的心肌损伤的作用及其机制

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

小结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢