犬去细胞喉支架两种体外保存方法的对照研究

摘要

头颈部肿瘤中喉癌是最常见的癌症，且发病率逐年递增。喉癌目前主要治疗方案仍为部分喉或全喉切除术[1]，术后长期声音嘶哑或者不能发音，并严重影响患者生活质量。据统计每年大约有25万的喉癌患者行喉全切除术[2]。喉全切除术后选择的一个积极治疗方案为喉移植。但是，到目前为止，人类历史上仅有2例成功的喉移植被报道[3,4]。临床上近年来在组织结构器官移植上进步很大，并且在组织工程方面去细胞的支架已经成功运用。在去细胞喉支架的方面，我科已经完成了兔和犬喉支架的灌注，并对这种支架的组织相容性、免疫原性、生物力学进行了检测，为构建去细胞同种异体喉软骨支架提供了理论和实验依据[5-9]。进行喉移植前去细胞喉支架需进行保存，以便为临床受体的选择创造时间。目前器官和软骨保存临床上常使用的方法有：冷冻保存、细胞培养液保存、器官保存液保存[10-14]。冷冻保存主要用于实质器官的保存，缺点为保存时间短，如果保存软骨，软骨细胞易失活。细胞培养液是主要用在保存和培养细胞方面。器官保存液也主要用来保存实质器官，目前未见用于保存去细胞支架的报道。去细胞喉支架应该如何保存？保存时间能否延长？保存后喉支架的结构能否起到支撑作用？软骨细胞能否存活？本实验比较了RPMI-1640培养基和HCA器官保存液两种保存方法对犬去细胞喉支架的软骨活性和软骨性能的影响，探讨去细胞喉支架保存的最佳方式和时间。
　　目的：
　　1.灌注法制备犬去细胞喉支架，探讨灌注后犬去细胞喉支架的外形、组织学、软骨细胞活性、生物力学的情况，并和两种体外保存后的支架进行比较。
　　2.通过对犬去细胞喉支架两种体外保存方法的对比研究，明确哪种方法更适合犬去细胞喉支架的保存，为下一步喉支架临床应用提供理论依据。
　　方法：
　　1.制备犬去细胞喉支架及其形态学研究
　　通过环甲动脉持续灌注 SDS、TritonX-100、PBS离子型去污剂，制备犬去细胞喉支架。在去除喉黏膜、肌肉、韧带内可溶性基质的同时，保留细胞外基质和低免疫原性的软骨细胞及完整的去细胞犬喉支架。制备完后，行大体观察、组织学观察及软骨活性检测。
　　2.犬去细胞喉支架体外保存的研究
　　实验组：将2组（各12只）犬去细胞喉支架分别放入RPMI-1640培养基内（A组）和HCA器官保存液内（B组）进行保存，1周、2周、4周、6周后取材。对照组（C组）：将另9只去细胞喉支架作为空白对照。3组均行大体观察、组织学检查、软骨细胞活性检测和生物力学性能检测的对比。
　　结果：
　　1.制备犬去细胞喉支架及其形态学研究
　　大体观察：犬去细胞喉支架结构完整、颜色苍白，触之有弹性，按压无变形。HE染色示：喉支架肌群去细胞完全，软骨细胞良好填充于软骨陷窝内。PDA-PI双荧光染色示：去细胞喉支架冰冻切片示软骨细胞发出黄绿色荧光，软骨陷窝内软骨细胞存活良好，结构完整。
　　2.犬去细胞喉支架的体外保存的研究
　　将实验组的2组犬去细胞喉支架保存4个时间段后取材进行检测。A组保存2周时和B组保存6周时去细胞喉支架外形变形明显，软骨细胞失活，压凹硬度试验硬度改变明显。保存2周、4周A、B两组组间甲状软骨厚度有明显统计学意义（t1=3.92，P1＜0.01；t2=4.54，P2＜0.01）。在保存2周、4周时A、B两组组间甲状软骨压缩模量比较有明显统计学意义（t1=3.36，P1＜0.01；t2=3.13，P2＜0.01）。B组保存4周时去细胞喉支架硬度、软骨细胞活性和甲状软骨压缩模量与对照组比较基本无明显变化。
　　结论：
　　1.通过环甲动脉灌注能够清除肌肉和黏膜的细胞成分，保留细胞外基质及软骨细胞，去细胞基本完全，生物力学性能良好，可得到完整的去细胞喉支架。
　　2.犬去细胞喉支架体外保存时，HCA器官保存液优于RPMI-1640培养基。HCA器官保存液保存4周时，去细胞支架外形、组织学观察及其生物力学性能无明显改变，是一种可供选择的去细胞喉支架体外保存液。

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缩略语表

中文摘要

英文摘要

前言

文献回顾

一、喉移植的概况

二、器官的保存研究进展

三、器官保存液的研究进展

实验一去细胞犬喉支架的制备及其形态学研究

1材料

2实验方法

3结果

4讨论

实验二 犬去细胞喉支架两种体外保存方法的对照研究

1材料

2方法

3结果

4讨论

小结

参考文献

附录

个人简历和研究成果

致谢