二氢青蒿素对超高分子量聚乙烯颗粒诱导的巨噬细胞炎性释放及骨溶解的影响

摘要

随着人口老龄化及预期寿命的增加，人工关节置换术在外科领域得到了广泛的开展和应用。据最新的统计数据显示，仅在美国每年就有一百多万例的髋、膝关节置换手术。人工关节置换术是目前公认的治疗终末期骨关节疾病的最有效方法。然而因此给临床提出了新的难题，即如何缓解假体周围骨溶解所带来的负作用和不利影响。人工关节假体周围骨溶解后所继发的无菌性松动是人工关节置换术后关节翻修的最重要原因之一。在传统的金属-聚乙烯摩擦界面中产生的UHMWPE颗粒诱发假体周围界膜组织内巨噬细胞的炎性激活，大量的炎性因子导致破骨细胞聚集和/或被激活，参与骨再吸收，导致骨溶解的发生和发展，是无菌性松动最重要的原因。为了延长假体的使用寿命和避免翻修手术高昂的费用，我们致力于探讨一种安全有效的临床用药来预防和治疗假体周围骨溶解后所继发的无菌性松动。
　　目前，非甾体类抗炎药、二磷酸盐类药物应用于临床防治人工关节置换术后假体无菌性松动，但这些药物不良反应明显，普遍不能长期使用。最新的药理学研究发现，二氢青蒿素除具有抗疟作用外，还具有高效的抗炎作用。但二氢青蒿素在防治人工关节置换术后假体无菌性松动方面尚无文献报道。
　　目的:
　　体内实验中，研究二氢青蒿素对超高分子量聚乙烯颗粒诱导的小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞源性炎性因子释放的影响。体外实验条件下，探讨二氢青蒿素对超高分子量聚乙烯颗粒诱导的小鼠颅骨骨溶解的影响。
　　方法:
　　实验一二氢青蒿素对UHMWPE颗粒诱导的巨噬细胞源性炎性因子的释放的影响
　　建立UHMWPE颗粒诱导的小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞源性炎性因子释放模型；施加不同浓度的二氢青蒿素观察药物对细胞的影响，酶联免疫分析法（ELISA）检测细胞培养液上清中TNF-α，IL-1β，IL-6和IL-10含量，MTT法检测细胞毒性反应。
　　实验二二氢青蒿素对UHMWPE颗粒诱导的小鼠颅骨骨溶解的作用
　　建立UHMWPE颗粒诱导的小鼠颅骨骨溶解模型；施加不同浓度的二氢青蒿素，颅骨组织培养24h后收集培养液上清，酶联免疫分析法（ELISA）检测细胞培养液上清中TNF-α，IL-1β，IL-6和IL-10含量。Mirco-CT扫描，对颅骨进行精确的三维立体重建，分析各项参数数据，包括骨矿物质密度和骨体积分数。颅骨标本病理组织学染色，采用苏木素-伊红染色和抗酒石酸酸性磷酸酶染色。使用OsteoporosisMeasure Analysis System和倒置相差显微镜及照相系统对H﹠E染色切片进行观察，计算目标区域面积内的骨溶解面积。TRAP染色切片观察，目标区域面积内行破骨细胞计数。
　　结果:
　　实验一
　　酶联免疫分析方法结果表明，二氢青蒿素可以显著抑制由UHMWPE颗粒诱导的小鼠RAW264.7细胞促炎细胞因子TNF-α,IL-1和IL-6的表达，并显著促进抗炎因子IL-10的释放，其效应具有剂量依赖性（P<0.05）。
　　实验二
　　1、酶联免疫分析方法结果表明，二氢青蒿素可以显著抑制由UHMWPE颗粒诱导的小鼠颅骨骨溶解模型促炎细胞因子TNF-α,IL-1和IL-6的表达，并显著促进抗炎因子IL-10的释放，其效应具有剂量依赖性（P<0.05）。
　　2、Mirco-CT扫描感兴趣区域（ROI）截面二维图，阳性对照组，低剂量药组，高剂量药组的颅骨冠状缝前囟区域都有明显的骨质溶解，阳性对照组骨吸收面积最大，用药组明显减少，且高剂量药组的骨破坏更少。Mirco-CT参数BMD和BV/TV都有相同的变化趋势。两项参数均是阳性对照组最低，表明骨溶解明破坏明显。用药组数值增大，且高剂量药组比低剂量药组的数值升高明显，表明二氢青蒿素高剂量组有效的抑制了骨溶解的发生（P<0.05）。
　　3、镜下H﹠E染色可见，阳性对照组相对于空白对照组有明显的骨膜增厚，大量炎性细胞浸润和沉积了UHMWPE颗粒的纤维组织增生，小鼠颅骨组织的骨连续性破坏明显，骨溶解区域显著增加。观察不同剂量二氢青蒿素用药组，高剂量组较之低剂量组，颅骨炎症反应明显降低，炎细胞浸润和骨组织连续性破坏明显降低。（P<0.05）使用OsteoporosisMeasure Analysis System和倒置相差显微镜及照相系统对H﹠E染色切片进行观察，目标区域内的骨溶解面积同样反映除了这种趋势。镜下TRAP染色切片观察，目标区域胞浆内呈现形态不规则的含紫红色或者大红色颗粒状的多核巨细胞，其周围面积不等的骨吸收陷窝。破骨细胞计数可见，阳性对照组破骨细胞明显活化增多，用药组中破骨细胞数量显著减少，且高剂量药组的抑制作用比低剂量组明显（P<0.05）。
　　结论:
　　二氢青蒿素具有显著的抗炎作用，体外实验中，可以显著的抑制UHMWPE颗粒诱导的巨噬细胞炎症反应，体内实验条件下，同样可以显著的抑制UHMWPE颗粒诱导的小鼠颅骨破骨细胞的生成和骨溶解的发生，其在预防人工关节置换术后假体无菌性松动的药物治疗方面具有潜在的作用。

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缩略语表

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前言

文献回顾

1.人工关节置换术

2.人工关节置换术后无菌性松动的发生机制

3. 磨损颗粒诱导的骨溶解发生过程中的细胞学机制

4.药物治疗假体周围骨溶解和无菌性松动的现状和探索

5.青蒿素及其衍生物的药理学作用和研究现状

实验一 二氢青蒿素对UHMWPE颗粒诱导的巨噬细胞源性炎性因子的释放的影响

1 实验材料

2 实验方法

3 实验结果

4 讨论

第二部分 二氢青蒿素对UHMWPE颗粒诱导的小鼠颅骨骨溶解的作用

1 实验材料

2 实验方法

3 实验结果

4 讨论

小结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢