miR-10b在人肝细胞肝癌发生中的作用及其机制的初步探索

摘要

背景:肝细胞肝癌（hepatocellular carcinoma,HCC）是一个多因素、多途径的复杂病变过程，具有发病隐匿、进展快、死亡率高的特点。因此，尽快从分子水平阐明HCC的发病机制对预防、诊断和治疗至关重要。探索染色体畸变和相关基因异常已成为肿瘤研究的重要切入点。其中，癌基因的过表达和抑癌基因的缺失或低表达是HCC发生、进展的关键环节，促进了肿瘤的恶性增殖和转移等生物学性状。因此，积极寻找新的诊断标记物、发现有效的作用靶点、探索HCC的侵袭转移机制，越来越多的受到人们的关注。
　　微小RNA（microRNA）（以下简称miRNA）是一类由17-25个核苷酸组成的非编码单链小RNA分子，参与转录后水平调控。成熟的miRNA与RNA沉默复合物（RNA-induced silencing complex,RISC）形成RISC-miRNA复合物。复合物与靶基因信使RNA（messenger RNA,mRNA）的3’-非翻译区（untranslated region,UTR）不完全配对结合调控靶基因的表达。miRNA具有组织、时序特异性，不同的肿瘤呈现出特异的miRNA表达谱，这为肿瘤的诊断、治疗和预后评估提供了新的可行的标记物和治疗干预靶点。目前，关于HCC相关miRNA表达谱的研究越来越多，并且报道了一些与HCC鉴别诊断、预后评估、侵袭转移等相关的miRNA，以此为临床应用提供新的、具有可行性和可操作性的科学依据。
　　通过对文献中的miRNA表达谱筛选和查阅相关文献，我们发现miR-10b在多种肿瘤组织中呈高表达，但在HCC中的表达变化及功能研究相对匮乏。miR-10b定位于2号染色体的HOX基因簇，推测其与肿瘤的侵袭转移密切相关。通过相关生物信息学方法及软件进行搜索、比对，我们发现CSMD1（CUB and Sushi multiple domains1）可能是miR-10b的靶基因。CSMD1是一个单次跨膜蛋白，位于氨基端的胞外区包含CUB和Sushi结构域，其功能可能与蛋白质-蛋白质和蛋白质-配体的相互作用有关，并且该区域有信号肽的存在；位于羧基端的胞浆区由63个氨基酸残基组成，有三个磷酸化位点。这表明CSMD1可能是膜受体或粘附因子，参与信号转导通路，从而参与HCC的发生、进展。近年来的研究显示，CSMD1是一个新候选的肿瘤抑制基因，但其在HCC中的研究极少。因此，我们首次在HCC中进行了miR-10b和CSMD1的相互关系及功能机制的研究，以阐明它们在HCC过程中的作用，从而为HCC的诊断和治疗提供新的候选基因和作用靶点。
　　目的:检测miR-10b在HCC组织中的表达，并阐明miR-10b与CSMD1在HCC中的相互关系及功能机制，为HCC的诊断和治疗提供新的候选基因和作用靶点。
　　方法:
　　1.利用实时荧光定量多聚酶链反应（real time quantitative polymerase chain reaction,qRT-PCR）检测miR-10b在HCC组织中的表达水平；
　　2.利用 qRT-PCR检测miR-10b在正常肝细胞和肝癌细胞系中的表达水平，筛选出miR-10b表达与HCC组织相一致的细胞系；采用脂质体2000转染miR-10b mimic、inhibitor及各自相应的阴性对照，分别进行MTT实验、Transwell实验、划痕实验、平板克隆形成实验和软琼脂克隆形成实验，并用流式细胞仪测定其对细胞周期和凋亡的影响，观察miR-10b对细胞生物学性状的影响；
　　3.采用裸鼠皮下成瘤实验，在瘤内多点注射agomir-10b及其阴性对照，观察miR-10b在体内环境对肿瘤生长性状的影响；
　　4.采用双荧光素酶报告实验验证miR-10b和CSMD1之间是否存在直接负转录调控作用，并明确其结合位点；利用qRT-PCR和免疫组化验证CSMD1和miR-10b在mRNA水平和蛋白水平是否存在负向表达调控关系；
　　5.采用脂质体2000转染CSMD1的siRNA及其阴性对照，利用qRT-PCR和细胞免疫组化检验转染效率后，进行MTT实验、Transwell实验，观察CSMD1对细胞生物学性状的影响；在免疫组化水平检测临床HCC病例中CSMD1的表达情况，分析CSMD1在HCC中的作用。
　　结果:
　　1.与非肿瘤肝组织相比，miR-10b在 HCC组织中的表达水平显著上调（-1.4590±0.69542 vs.-1.7312±0.62758,p<0.01），且miR-10b的表达水平与患者年龄、HBV感染有相关性；
　　2. MTT、平板克隆形成实验和软琼脂克隆形成实验结果显示miR-10b促进细胞增殖；划痕实验和Transwell实验结果显示miR-10b促进细胞迁移和侵袭；流式细胞仪检测结果显示miR-10b促进细胞增殖、抑制细胞凋亡；
　　3.裸鼠皮下成瘤实验结果显示，与对照组相比，agomir-10b组肿瘤生长更快，体积更大；
　　4.双荧光素酶报告实验结果显示miR-10b对CSMD13’UTR有直接负转录调控作用，结合位点为707-713位点；qRT-PCR和免疫组化结果显示miR-10b与CSMD1之间呈负表达调控关系；
　　5. CSMD1的siRNA沉默效率达到70％左右，MTT实验结果显示CSMD1低表达促进细胞增殖；Transwell实验结果显示CSMD1低表达促进细胞迁移和侵袭；与非肿瘤肝组织相比，临床HCC中CSMD1呈低表达。
　　结论:
　　1.与非肿瘤肝组织相比，miR-10b在HCC中的表达显著上调，且miR-10b上调的水平与患者年龄及HBV感染呈正相关，提示miR-10b可能与HCC发生有相关；
　　2.miR-10b促进肝癌细胞增殖、迁移、侵袭，并抑制肝癌细胞凋亡，且miR-10b在体内环境又促进肿瘤生长，提示miR-10b在HCC发生中可能具有癌基因的功能；
　　3.miR-10b与HCC发生相关作用机制可能与miR-10b负向调控CSMD1基因表达有关，CSMD1在HCC中具有抑癌基因的功能；
　　综上所述，本研究首次发现miR-10b与HCC发生相关，其作用机制可能与miR-10b负向调控CSMD1基因表达有关。研究结果为HCC病因及分子遗传学研究提供了新的思路，也为HCC的个体化诊断提供了新的潜在分子标志物。

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缩略语表

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前言

文献回顾

1.HCC的发生及相关抑癌基因

2.miRNA 的生物学特性及在肿瘤发生发展中的作用

3.CSMD1在HCC中的研究进展

第一部分 miR-10b在HCC中的表达以及临床意义

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

第二部分 miR-10b对肝癌细胞生物性状的影响

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

第三部分 miR-10b对裸鼠皮下成瘤的影响

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

第四部分 miR-10b与CSMD1靶向关系的研究

1 材料

2 方法

3结果

4 讨论

第五部分 CSMD1在肝癌细胞系和HCC中功能的初步探索

1 材料

2 方法

3结果

4 讨论

小结

参考文献

附录

个人简历和研究成果

致谢