T型钙离子通道α1H(Cav3.2)亚型在先天性巨结肠中的表达及其相关功能的初步研究

摘要

背景：
　　先天性巨结肠(Hirschsprung’s disease，HSCR)是一种严重且常见的小儿先天性畸形，虽然手术可以挽救生命，但许多患儿仍然合并长期慢性并发症，严重影响患儿生活质量。而解决和缓解患儿肠动力障碍是保守治疗的关键。HSCR临床与动物模型的病理标本研究均表明HSCR患儿严重的肠动力障碍与Cajal间质细胞（interstitial cells of Cajal，ICC）的分布、数量及功能异常密切相关。近年来，T型钙离子通道α1H（Cav3.2）亚型已被证实在 ICC起搏电位的产生与传播中发挥着举足轻重的作用，然而关于Cav3.2在HSCR肠动力障碍发生机制中的角色尚不清楚。在本研究中，我们首先通过免疫组织化学，qRT-PCR，Western blot的方法来证实正常结肠中T型钙离子通道亚型的分布以α1H（Cav3.2）亚型为主。其次，通过建立HSCR动物模型，检测HSCR病变肠段中Cav3.2的表达变化，明确Cav3.2与HSCR之间的相关关系。最后，利用Cav3.2的特异性拮抗剂和激动药物在肌条电生理实验中对HSCR病变肠段及正常对照肠段肌条进行干预，分析Cav3.2对肌条收缩的影响及它们之间可能存在的相互作用机制，从而对Cav3.2在HSCR肠动力障碍发生发展中的作用及其机制进行初步探讨。
　　目的：
　　1.通过免疫组织化学，qRT-PCR和蛋白免疫印迹的方法检测正常结肠中T型钙离子通道亚型（Cav3.1, Cav3.2, Cav3.2）的分布情况。
　　2.通过免疫组织化学，蛋白免疫印迹和免疫荧光双标技术明确Cav3.2及ICC特异性标记物c-kit在HSCR中各自及共同阳性区域表达变化。
　　3.利用Cav3.2的特异性拮抗剂和激动药物在肌条电生理实验中对HSCR病变肠段及正常对照肠段肌条进行干预，分析Cav3.2对肌条收缩的影响从而初步阐明Cav3.2在HSCR肠动力障碍发生中的作用。
　　方法：
　　1.取自5只SD大鼠的结肠，以其大脑组织中的神经元作为阳性对照，利用免疫组织化学、qRT-PCR、Western blot的方法对结肠中T型钙通道亚型的分布进行检测。
　　2.将80只6-8日龄SD乳鼠随机分为两组，每组40只。干预组经肛门灌注0.2％苯扎氯铵建立HSCR模型，对照组用生理盐水代替苯扎氯铵进行干预。分别在第4、6、8周每组随机抽取10只动物处死，通过大体形态学观察、组织病理学观察、免疫荧光的方法来鉴定HSCR模型是否建立成功。同时通过免疫组化、蛋白免疫印迹和免疫荧光双标技术检测模型大鼠病变肠段中 Cav3.2的分布变化及其与ICC特异性标记物c-kit共变情况。
　　3.选取建模8周的HSCR大鼠和正常对照大鼠的结肠，利用离体肌条电生理学方法对HSCR病变肠段和正常结肠中的Cav3.2的功能变化进行研究。同时利用Cav3.2的特异性拮抗剂ZnCl2和激动药物Na2S对Cav3.2在肠动力中的调节作用进行研究。
　　结果：
　　1.免疫组织化学检测正常结肠组织中T型钙离子通道亚型分布的结果显示：少量的Cav3.1分布于正常结肠组织的粘膜层及粘膜下层；Cav3.3几乎没有表达；而Cav3.2是正常结肠组织中主要表达的T型钙离子通道亚型，其主要分布于环行肌与纵行肌之间，多呈连续分布。qRT-PCR、Western blot结果与免疫组织化学检测结果基本一致，即正常结肠中主要表达的T型钙离子通道亚型是Cav3.2，Cav3.1和Cav3.3几乎没有表达。
　　2.经肛门灌注0.2%苯扎氯铵处理后8周通过大体形态学观察，组织病理学观察，免疫荧光方法鉴定HSCR模型建立成功，即处理肠段肌间神经节细胞的减少甚至缺如。免疫组织化学方法检测结果显示：在正常结肠组织中，Cav3.2主要分布于环行肌与纵行肌之间，多呈连续分布；而在HSCR模型动物病变肠段，随着处理时间的延长，Cav3.2的分布逐渐减少，连续性遭到破坏。蛋白免疫印迹检测的HSCR病变肠段Cav3.2蛋白表达的变化，结果与免疫组织化学检测一致，随着处理时间的延长，Cav3.2的表达逐渐减少，8周时减少最明显(t=8.626, P<0.001)。免疫荧光双标检测Cav3.2和ICC特异性标记物c-kit共变情况显示：与正常结肠组织中的分布情况相比，HSCR病变肠段组织c-kit和Cav3.2的共同阳性区域明显减少甚至消失。
　　3.离体肌条组织电生理结果发现：①与对照组正常结肠肌条相比，HSCR病变肠段组织的自发性节律性收缩波基本消失；②在正常结肠肌条产生自发性节律性收缩的前提下，加入Cav3.2的特异性阻滞剂ZnCl2后，肌条的节律性收缩基本消失，与 HSCR病变肠段表现类似；而在 HSCR病变肠段肌条的灌流槽中加入 Cav3.2的特异性阻滞剂ZnCl2后，肌条的收缩活动未出现明显变化；③在正常结肠肌条产生自发性节律性收缩的前提下，向灌流槽中加入Cav3.2的激动药物Na2S后，肌条收缩张力显著增加(t=125.726, P<0.001)；而在HSCR病变肠段肌条的灌流槽中加入 Cav3.2的激动药物 Na2S后，肌条的收缩曲线变化不明显(t=1.293, P=0.237)；④在正常结肠肌条用 ZnCl2特异性阻滞 Cav3.2后，加入上调 Cav3.2的Na2S，肌条收缩张力明显增加(t=32.294, P<0.001)；而在HSCR病变肠段肌条用ZnCl2特异性阻滞Cav3.2后，加入上调Cav3.2的Na2S，肌条收缩活动均无明显变化。
　　结论：
　　HSCR病变肠段组织T型钙离子通道α1H（Cav3.2）亚型的表达及其与特异性标记ICC的c-kit的共同阳性区域与正常结肠中的表达相比，均明显减少。HSCR病变肠段组织的自发性节律性收缩波基本消失；对照组加入Cav3.2的特异性阻滞剂ZnCl2后，正常结肠肌条的自发性节律性收缩消失，与HSCR病变肠段组织表现类似。以上结果提示Cav3.2的异常很可能介导了HSCR肠段中ICC功能的改变，并最终导致HSCR肠动力障碍的出现，从而为我们进一步探讨 HSCR的发病机理奠定了理论基础。

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前言

文献回顾

一、肠动力障碍是HSCR主要的临床症状，也是临床治疗的关键环节。

二、HSCR肠动力障碍与ICC分布、数量及功能异常有关。

三、钙离子对ICC起搏功能的形成，发挥始动作用。

四、T型钙离子通道是胃肠道ICC起搏电位形成过程中外钙内流的主要离子通道。

五、本课题的研究设想

第一部分 正常结肠中T型钙离子通道亚型分布的检测

引言

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

第二部分 HSCR动物模型结肠组织中Cav3.2表达变化的研究

引言

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

第三部分 肌条电生理检测HSCR中Cav3.2功能变化的研究

引言

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

小结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢