microRNA在氧醚复合保护脓毒症效应机制中的作用

摘要

Sepsis（脓毒症）是一种因为感染而导致的一系列病理、生理方面的异常，是导致全世界感染患者致死致残的重要因素，一直是医学界关注的焦点。我们的前期研究证实：
　　（1）0.5MAC异氟醚复合60％氧对脓毒症具有保护效应；
　　（2）通过芯片研究，我们筛选确定了4个脓毒症相关的miRNA：CLP可诱导小鼠外周血白细胞miR-133a-3p、miR-141-3p、miR-3074-2-3p和miR-542-3p的高表达，给予0.5MAC异氟醚复合60%氧治疗可逆转这4个miRNA的高表达。但这4个miRNA在中性粒细胞、单核细胞、淋巴细胞等的表达情况尚不清楚；目前公认的是，巨噬细胞在脓毒症病理生理机制中起关键作用。我们预实验结果表明，LPS刺激可诱导miR-133a-3p、miR-141-3p、miR-3074-2-3p和miR-542-3p在RAW264.7细胞中的表达显著升高。本研究拟探讨miR-133a-3p、miR-141-3p、miR-3074-2-3p和miR-542-3p在氧醚复合治疗脓毒症效应机制中的作用，并探讨这些miRNA成为治疗脓毒症新靶点的可能。
　　材料与方法
　　1.miRNA通过NF-κB信号通路参与氧醚复合保护脓毒症效应
　　（1）细胞实验：将RAW264.7巨噬细胞，随机分为10组：Vehicle组、LPS组、Vehicle+0.5MAC ISO+60% Oxy组、LPS+0.5MAC ISO+60% Oxy组、LPS+LV-/mimic-/antigomo-miR-133a-3p+0.5MAC ISO+60% Oxy组、LPS+LV-/mimic-/antigomo-miR-141-3p+0.5MAC ISO+60%Oxy组、LPS+LV-/mimic-/antigomo-miR-3074-2-3p+0.5MAC ISO+60% Oxy组、LPS+LV-/mimic-/antigomo-miR-542-3p+0.5MAC ISO+60% Oxy组、LPS+LV-/mimic-/antigomo-miR-mix+0.5MAC ISO+60%Oxy组和LPS+LV-/mimic-/antigomo-NC+0.5MAC ISO+60%Oxy组。用携带LV3-mmu-miR-133a-3p、LV3-mmu-miR-141-3p、LV3-mmu-miR-3074-2-3p和LV3-mmu-miR-542-3p质粒的慢病毒感染RAW264.7细胞72 h后，或者转染 miR-133a-3p mimic/antigomo、miR-141-3p mimic/antigomo、miR-3074-2-3p mimic/antigomo和miR-542-3p mimic/antigomo于RAW264.7细胞12 h后，给予细胞100 ng/ml LPS刺激至少2小时建立细胞脓毒症模型。氧醚治疗：给予LPS刺激后即刻将细胞置于0.5MAC异氟醚复合60%氧气环境处理2 h。收集细胞培养上清液检测炎症因子 TNF-α和 IL-1β水平；免疫印迹法检测细胞核蛋白、细胞浆蛋白p65表达情况和全蛋白p-p65、p65表达情况。
　　（2）动物实验：将雄性昆明小鼠随机分为9组：Sham+Air组、CLP+Air组、CLP+0.5MAC ISO+60% Oxy组、CLP+LV-NC+0.5MAC ISO+60% Oxy组、CLP+LV-miR-133a-3p+0.5MAC ISO+60%Oxy组、CLP+LV-miR-141-3p+0.5MAC ISO+60% Oxy组、CLP+LV-miR-3074-2-3p+0.5MAC ISO+60% Oxy组、CLP+LV-miR-542-3p+0.5MAC ISO+60% Oxy组和 CLP+LV-miR-mix+0.5MAC ISO+60% Oxy组。给小鼠尾静脉注射携带 LV3-mmu-miR-133a-3p、LV3-mmu-miR-141-3p、LV3-mmu-miR-3074-2-3p和LV3-mmu-miR-542-3p质粒的慢病毒，48 h后建立CLP脓毒症模型。氧醚治疗：造模后1、6小时分别吸入1小时的氧醚复合气体，对照组在相同时间内吸入空气。记录动物7天存活率。
　　2.抑制miRNA表达对脓毒症的保护效应研究
　　（1）动物实验：将雄性昆明小鼠随机分为8组：Sham组、CLP组、CLP+LV-NC inhibitor/antigomo-NC组、CLP+LV-miR-133a-3p inhibitor/antigomo-miR-133a-3p组、CLP+LV-miR-141-3p inhibitor/antigomo-miR-141-3p组、CLP+LV-miR-3074-2-3p inhibitor/antigomo-miR-3074-2-3p组、CLP+LV-miR-542-3p inhibitor/antigomo-miR-542-3p组和CLP+LV-miR-mix inhibitor/antigomo-miR-mix组。给小鼠尾静脉注射LV3-mmu-miR-133a-3p-inhibitor、LV3-mmu-miR-141-3p-inhibitor、LV3-mmu-miR-3074-2-3p-inhibitor或 LV3-mmu-miR-542-3p-inhibitor质粒的慢病毒，48 h后建立CLP脓毒症模型。尾静脉注射miRNA antigomo时间：CLP前48 h或CLP后24 h。记录动物7天存活率。
　　（2）细胞实验：将RAW264.7巨噬细胞，随机分为8组：Vehicle组、LPS组、LPS+LV-NC inhibitor/antigomo-NC组、LPS+LV-miR-133a-3p inhibitor/antigomo-miR-133a-3p组、LPS+LV-miR-141-3p inhibitor/antigomo-miR-141-3p组、LPS+LV-miR-3074-2-3p inhibitor/antigomo-miR-3074-2-3p组、LPS+LV-miR-542-3p inhibitor/antigomo-miR-542-3p组和LPS+LV-miR-mix inhibitor/antigomo-miR-mix组。用携带 LV3-mmu-miR-133a-3p-inhibitor、LV3-mmu-miR-141-3p-inhibitor、LV3-mmu-miR-3074-2-3p-inhibitor或 LV3-mmu-miR-542-3p-inhibitor质粒的慢病毒感染RAW264.7细胞72 h，或者转染miR-133a-3p antigomo、miR-141-3p antigomo、miR-3074-2-3p antigomo和miR-542-3p antigomo于RAW264.7细胞12 h后，给予细胞100 ng/ml LPS刺激2小时建立细胞脓毒症模型。收集细胞培养上清液检测炎症因子TNF-α、IL-1β水平。
　　结果：
　　1.本研究中，我们观察到，LPS刺激后，RAW264.7细胞释放TNF-α和IL-1β显著增多（P＜0.05）；给予氧醚复合干预可显著抑制LPS刺激所致细胞炎症因子释放的增加（P＜0.05）。高表达miR-133a-3p及miR-3074-2-3p可显著逆转氧醚复合对LPS刺激所致细胞释放TNF-α增加的抑制效应（P<0.05）；高表达miR-542-3p可显著逆转氧醚复合对LPS刺激所致细胞释放IL-1β增加的抑制效应（P<0.05）。给予miR-133a-3p mimic、miR-3074-2-3p mimic及同时给予上述4个miRNA mimic可显著逆转氧醚复合对LPS刺激所致细胞释放 TNF-α增加的抑制效应（P<0.05）；给予miR-542-3p mimic及同时给予上述4个miRNA mimic可显著逆转氧醚复合对LPS刺激所致细胞释放IL-1β增加的抑制效应（P<0.05）。给予miR-133a-3p antigomo、miR-3074-2-3p antigomo及同时给予上述4个miRNA antigomo可显著增强氧醚复合对LPS刺激所致细胞释放TNF-α增加的抑制效应（P<0.05）；给予miR-542-3p antigomo及同时给予上述4个miRNA antigomo均可显著增强氧醚复合对LPS刺激所致细胞释放IL-1β增加的抑制效应（P<0.05）。LPS刺激可上调RAW264.7细胞p-p65表达增加，细胞核p65表达增加，细胞浆p65表达减少，提示：LPS刺激后细胞内NF-κB信号通路被激活。给予氧醚复合干预可抑制LPS诱导的NF-κB信号通路激活；预先高表达上述4个miRNA可部分逆转氧醚复合干预对LPS刺激后NF-κB信号通路激活的抑制效应。
　　动物实验：与假手术组相比，CLP组小鼠存活率显著下降（P<0.05），给予氧醚复合可显著提高CLP动物的存活率（P<0.05）；高表达miR-141-3p及同时高表达上述4个miRNA可显著减弱氧醚复合提高CLP小鼠存活率的效应（P<0.05）。
　　2.我们观察到，分别给予miR-133a-3p、miR-141-3p、miR-3074-2-3p和miR-542-3p inhibitor可提高CLP小鼠的存活率，但没有统计学差异；而同时给予上述4个miRNA inhibitor可显著提高CLP小鼠的存活率（P＜0.05）。此外，造模前同时给予上述4个miRNA antigomo可显著提高CLP小鼠的存活率（P＜0.05）；造模后分别或同时给予上述4个miRNA antigomo也可提高CLP小鼠的存活率，但没有统计学差异。
　　给予miR-133a-3p inhibitor、miR-3074-2-3p inhibitor及同时给予上述4个miRNA inhibitor可显著抑制LPS刺激后细胞培养上清液TNF-α水平的增高（P＜0.05）；给予miR-133a-3p inhibitor、miR-141-3p inhibitor、miR-542-3p inhibitor和同时给予上述4个 miRNA inhibitor可显著抑制 LPS刺激后细胞培养上清液IL-1β水平的增高（P＜0.05）。给予 miR-133a-3p antigomo、miR-3074-2-3p antigomo、miR-542-3p antigomo及同时给予上述4个miRNA antigomo可显著抑制LPS刺激后细胞培养上清液TNF-α水平的增高（P＜0.05）；给予miR-3074-2-3p antigomo及同时给予上述4个miRNA antigomo可显著抑制LPS刺激后细胞培养上清液IL-1β水平的增高（P＜0.05）。
　　结论：
　　由以上结果可知：
　　（1）miRNA介导的NF-κB炎性通路参与了0.5MAC异氟醚复合60%氧对脓毒症的保护效应；
　　（2）抑制miR-133a-3p、miR-141-3p、miR-3074-2-3p或 miR-542-3p具有抗炎效应，并对 CLP所致脓毒症有保护效应，提示这4个miRNA有可能成为治疗脓毒症的新靶点。

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声明

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缩略语表

中文摘要

英文摘要

前言

文献回顾

一、脓毒症

二、吸入麻醉药和氧疗与危重病的关系

三、脓毒症的免疫炎性反应机制

四、miRNA简介

五、实验性脓毒症模型

第一部分miRNA通过介导NF-κB信号通路参与氧醚复合保护效应

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

第二部分 抑制miRNA表达对脓毒症的保护效应研究

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

小结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢