化学修饰的凋亡细胞诱导小鼠皮肤移植耐受研究

摘要

临床上异体皮肤移植最早起源于第二次世界大战期间，当时大面积烧伤病人较多,创面难于愈合，为了挽救病人生命，一些医生尝试了异体植皮。由于当时缺乏对主要组织相容性抗原（Major Histocompatibility Complex, MHC）以及移植排斥的认识，异体植皮几乎都失败了。直到1953年，Medward等人总结报道了不同个体之间移植排斥的基本现象。后来，他成功的诱导了小鼠异体皮肤移植耐受，这为组织和器官移植领域做出了开创性贡献，也正是因为这一贡献，Medward获得了诺贝尔生理性或医学奖。皮肤移植得以成功诱导耐受后，也掀起了实体器官移植耐受的研究以及临床实体器官移植的开展。近几十年来，实体器官移植成为了挽救终末期器官的有效手段，而异体皮肤移植却没有得到很好推广。这是因为大多数学者认为皮肤免疫原性高，排斥不易控制。近10年来，随着免疫抑制剂的发展以及实体器官移植经验的积累，一些机构小心谨慎的尝试了带有皮肤的异体复合组织移植（Composite Tissue Allotransplantation, CTA）如：脸移植、手移植、阴茎移植、腹壁移植等等。这些移植物在临床修复效果得到了肯定，但是目前仍然存在着一些问题，其中最突出的问题是皮肤移植排斥的机制仍然不够清楚，在临床，皮肤仍然显示出较高的急性排斥机率。我们大部分对于皮肤排斥的认识都是来自Medward等人构建的传统的皮片移植模型。然而临床含皮肤的CTA移植是血管化的，这种移植物中皮肤的排斥机理与皮片移植是否一样，目前仍然不清楚。因此，构建合适的动物模型去探究皮肤移植排斥机理显得十分重要。另一方面，临床上 CTA移植大多情况下并不是一种挽救生命的手术，构建可靠有效并且实用的耐受诱导方案仍然是目前研究的重点之一。
　　细胞凋亡是正常的生理现象，在生理状态下，吞噬细胞会迅速识别、吞噬这些凋亡细胞，而不会产生炎症或免疫反应以维持体内的稳态。学者发现，吞噬细胞吞噬凋亡细胞后可促进分泌抑制性细胞因子IL-10和TGF-β，并抑制其分泌促炎因子TNF-α和IL-1β等。基于此类发现，一些研究者利用凋亡的异体细胞来调节免疫系统，成功诱导了同种异体骨髓、心脏和胰岛细胞移植的长期免疫耐受。在众多诱导凋亡的方法中，乙基碳二亚胺（Ethylene Carbodiimide, ECDI）化学修饰的凋亡细胞显示出了较高的效率和成功率。这种耐受诱导方法较为温和，不需要对受体进行照射等预处理，有着很大的优势。本研究也将尝试ECDI在体外修饰供者脾细胞，过继传输给受体以诱导小鼠皮肤移植耐受。
　　目的：1.通过血管吻合“袖套”（Cuff）技术构建一个简便易行的小鼠血管化皮肤移植模型，并通过该模型比较传统植皮与血管化皮瓣在移植排斥反应中的差异。2.利用 ECDI修饰的供体来源的小鼠脾细胞在移植前及移植后静脉输注给受体小鼠，尝试诱导小鼠异体皮片及皮瓣移植耐受。
　　方法：1.以C57BL/6小鼠为受体，以BALB/C（异基因）或C57BL/6（同基因）小鼠为供体，以供体小鼠股动静脉为蒂形成皮瓣，将预先准备好的CUFF管置于供体血管蒂上。再将带有 CUFF管的供体皮瓣分别转移至受体小鼠的颈部或者是腹股沟，以形成颈部皮瓣或腹股沟皮瓣。颈部皮瓣将供体股动脉与颈动脉相互吻接，股静脉与颈外静脉相互吻接；腹股沟皮瓣血管蒂原位相接。异体皮瓣移植的小鼠术后给予3 mg/kg/d雷帕霉素。记录两种小鼠皮瓣移植方法在手术成功率、手术时间、缺血时间以及并发症的差异。此外，我们还构建了传统的皮片移植模型。利用这两类模型，我们比较了异体非血管化皮片和血管化皮瓣移植排斥反应的差异。2.体外利用不同浓度ECDI与供体脾细胞冰上共培养1 h，检测不同时间点细胞凋亡情况；利用ECDI-SP在体外与受体脾细胞共培养，检测细胞培养上清液中IL-10、TGF-β的变化。3.利用实验1所建立的小鼠尾部全厚皮片移植模型和皮瓣移植模型，皮片移植随机法分4组。雷帕霉素(Rapamycin, RAPA)组：单独使用3 mg/kg雷帕霉素至术后28天或排斥终点；ECDI-SP+RAPA组：移植前7天及移植后1天输注3×107 ECDI-SP联合雷帕霉素组28天；SP+RAPA组：移植前7天及移植后1天输注未经处理脾细胞联合雷帕霉素组；第三方移植C3H组：移植前7天、移植后1天输注ECDI-SP联合雷帕霉素组，移植皮片为第三方小鼠 C3H品系。皮瓣移植组随机分为了3组：对照组：不作任何处理；RAPA组：皮瓣移植术后给与3 mg/kg/d的雷帕霉素，28天后停药；ECDI-SP+RAPA组：术前7天以及术后1天静脉给与供体来源的3×107 ECDI-SP联合雷帕霉素组28天。术后记录了移植物排斥情况，并取相应病理标本进行苏木精-伊红染色（Hemotoxylin and eosin staining, HE）染色。在移植术后第10天，取受体小鼠脾细胞进行混合淋巴细胞反应和 CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞（Regulatory T cells, Treg）的测定。
　　结果：1.我们成功的构建了小鼠血管化皮肤移植模型。与腹股沟原位移植相比，颈部皮瓣在手术成功率，移植物缺血时间以及术后并发症都有优势。单纯异体皮片与皮瓣移植在不用免疫抑制剂的情况下排斥反应几乎同步。但是，3 mg/kg/d雷帕霉素能明显延长小鼠皮瓣存活，却无法延长小鼠皮片存活。从皮片与皮瓣急性排斥病理图可以看出，皮片炎性细胞浸润最严重是在第7天，而皮瓣炎性细胞浸润则要早一些，第3天较为严重，但是其排斥速度远不如皮片快。2.30 mg/ml ECDI处理的脾细胞迅速发生了凋亡；ECDI-SP能够在体外诱导受体小鼠脾细胞分泌抑制性细胞因子IL-10。3. ECDI-SP输注明显延长了同种异体小鼠皮片及皮瓣存活时间（P<0.01)，而C3H组皮片存活时间并没有延长（P>0.05），ECDI-SP输注后小鼠体内Treg比例增加（P<0.01)。在第10天 ECDI-SP+RAPA组受体小鼠对供体来源抗原反应性低于其他组小鼠。
　　结论：1.小鼠血管化皮瓣移植是一个可靠的复合组织移植模型。相比而言，颈部皮瓣比腹股沟皮瓣在手术时间、术后并发症控制上更具优势。2.传统皮片移植与血管化皮瓣移植皮肤所表现出的排斥反应不一致，皮片排斥反应更强。3. ECDI在体外能够诱导供体脾细胞凋亡，30 mg/ml ECDI诱导细胞凋亡比率较高，细胞坏死率相对较低；ECDI-SP在体外能够诱导受体小鼠脾细胞表达IL-10。ECDI-SP能延长同种异体小鼠皮片及皮瓣移植存活时间，可能机制与CD4+CD25+Foxp3+Treg比例增加有关。

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前言

文献回顾

1 皮肤移植物的免疫学特性及临床应用

2 实验室含皮肤CTA动物模型研究进展

3 凋亡细胞诱导免疫耐受进展

第一部分 小鼠皮片与血管化皮瓣移植模型的构建及其移植排斥差异对比

1 材料

2 实验方法

3 结果

4 讨论

第二部分 化学修饰的凋亡细胞诱导小鼠皮片或皮瓣移植耐受的研究

1 材料

2 实验方法

3 结果

4 讨论

小结

参考文献

附录

个人简历和研究成果

致谢