FA-PEG-hyd-DOX连接物的稳定性、药物动力学及抗肿瘤活性研究

摘要

阿霉素（doxorubicin,DOX）具有抗瘤谱广、疗效确切、价廉易得等优点，被广泛应用于乳腺癌、膀胱癌等实体肿瘤的治疗。但是DOX存在严重的心脏毒性、骨髓抑制作用以及较高的耐药性等弊端而限制了它的临床应用。由于大分子肿瘤靶向药物具有对肿瘤组织选择性高、在正常组织中分布少、能有效增加药物在体内的循环时间等优点，成为新药研发的热点。
　　目的：
　　本研究制备了新型DOX大分子肿瘤靶向连接物FA-PEG-hyd-DOX，并对FA-PEG-hyd-DOX连接物的冻干粉制剂、稳定性、体内药物动力学、药效学进行研究，阐明其成药特性，为FA-PEG-hyd-DOX连接物的开发应用奠定基础。
　　方法：
　　本研究以叶酸作为肿瘤靶向配体、以聚乙二醇作为大分子药物载体、以DOX为活性药物，制备新型DOX大分子肿瘤靶向连接物FA-PEG-hyd-DOX。依据2010版《中国药典》二部附录XIXC《原料药与药物制剂稳定性试验指导原则》及《ICHQ1-新原料药和制剂的稳定性试验》，对DOX、FA-PEG-hyd-DOX连接物及FA-PEG-hyd-DOX连接物冻干粉制剂进行稳定性考察。采用HPLC-DAD法检测DOX、FA-PEG-hyd-DOX连接物及其冻干粉制剂在影响因素试验、加速试验及长期试验条件下DOX质量百分含量的变化，采用X-4显微熔点测定仪测定熔点变化并同时考查试验前后外观性状变化。采用HPLC-DAD法研究DOX及FA-PEG-hyd-DOX连接物在大鼠体内的药物动力学。通过对裸鼠皮下注射HepG2细胞构建肿瘤模型，分别给予0.9％氯化钠注射液、游离DOX（5.0 mg/kg）及FA-PEG-hyd-DOX连接物（含DOX2.5 mg/kg、5.0 mg/kg、10 mg/kg）。对裸鼠体重、肿瘤体积、生存情况进行动态监测。给药结束后，采用HE染色法观察荷瘤裸鼠主要器官组织的形态变化。采用活体成像仪及荧光显微镜观察DOX在荷瘤裸鼠脑、心脏、肝脏、脾脏及肿瘤等组织中的分布情况。
　　结果：
　　1.通过1H NMR和IR等方法证实合成的终产物为目标产物。
　　2.影响因素试验结果表明，DOX、FA-PEG-hyd-DOX连接物的稳定性与温度、湿度、光照密切相关。DOX在高温、高湿、强光照环境中放置10天后，DOX质量百分含量分别为31.95%、66.36%和61.27%，熔点分别为195℃、194℃和194℃。FA-PEG-hyd-DOX连接物在高温、高湿、强光照环境中放置10天后，DOX质量百分含量分别为2.71%、3.85%和3.14%，熔点范围分别为169~175℃、170~175℃和170~175℃。FA-PEG-hyd-DOX连接物10%甘露醇冻干粉制剂在高温、高湿、强光照环境中放置10天后，DOX质量百分含量分别为3.80%、5.76%和4.80%。相同条件下，FA-PEG-hyd-DOX连接物的稳定性高于DOX，FA-PEG-hyd-DOX连接物10%甘露醇冻干粉制剂稳定性明显高于FA-PEG-hyd-DOX连接物。FA-PEG-hyd-DOX连接物10%甘露醇冻干粉制剂在置于加速试验条件下6个月后，以及置于长期试验条件下12个月后，其稳定性好。上述结果提示FA-PEG-hyd-DOX连接物10%甘露醇冻干粉制剂稳定性好，FA-PEG-hyd-DOX连接物10%甘露醇冻干粉制剂适宜于常温、密封、避光保存。
　　3.尾静脉注射给予1.75 mg/kg DOX后，DOX在SD大鼠体内的半衰期为7.0 h，AUC为278μg·min·L-1。尾静脉注射给予1.75mg DOX/kg、3.5 mg DOX/kg、7 mg DOX/kg的FA-PEG-hyd-DOX连接物后，DOX在SD大鼠体内的半衰期分别为36.4 h、38.5 h和36.7 h，AUC0-72分别为542μg·min·L-1、1092μg·min·L-1和1781μg·min·L-1。上述结果表明，与DOX组相比较，FA-PEG-hyd-DOX连接物增加了DOX在SD大鼠血液中的循环时间，提高了DOX在大鼠血液中的循环总量。
　　4.荷瘤裸鼠给予游离DOX后，裸鼠精神状态差、消瘦、行动迟缓，FA-PEG-hyd-DOX连接物给药组裸鼠生存状态良好。这在一定程度上反应出了游离DOX的毒性作用。荷瘤裸鼠开始给药时，肿瘤体积约为50 mm3。通过给予生理盐水、5 mg/kg游离DOX、2.5 mg DOX/kg FA-PEG-hyd-DOX连接物、5 mg DOX/kg FA-PEG-hyd-DOX连接物以及10 mg DOX/kg FA-PEG-hyd-DOX连接物进行抗肿瘤治疗，到试验结束时，各组肿瘤体积分别增加了1322%、278%、510%、156%、13%。与DOX相比，FA-PEG-hyd-DOX连接物表现出了良好的抗肿瘤作用。荷瘤裸鼠生存时间曲线表明，与游离DOX相比，FA-PEG-hyd-DOX延长了荷瘤裸鼠生存时间。荷瘤裸鼠各器官组织的H&E染色结果表明，游离DOX给予荷瘤裸鼠后，其心脏组织形态发生了较大的变化，肿瘤组织有极少量的中性粒细胞浸润，肿瘤细胞坏死较少。FA-PEG-hyd-DOX连接物给药后，脑、心、脾、肝、肾、肺等组织的形态未发现显著变化，而肿瘤组织有大量的炎性细胞和中性粒细胞浸润，肿瘤细胞大量坏死。活体成像结果表明，荷瘤裸鼠给予游离DOX后，在脑、心、肝、脾、肺、肾及肿瘤组织均有DOX分布。荷瘤裸鼠给予FA-PEG-hyd-DOX连接物后，DOX在肿瘤组织的蓄积显著增多，并且给药24 h后，肿瘤组织DOX的蓄积量明显高于12 h，同时DOX在正常组织的分布明显减少。随着FA-PEG-hyd-DOX连接物给药剂量的增加，肿瘤组织DOX的蓄积量明显增多。荧光显微镜观察结果表明，荷瘤裸鼠给予游离DOX后，DOX红色荧光在荷瘤裸鼠脑、心脏、肝脏、脾脏、肺、肾等器官组织切片中分布较多，在肿瘤组织切片中的分布较少；荷瘤裸鼠给予FA-PEG-hyd-DOX连接物后，DOX红色荧光在荷瘤裸鼠脑、心脏、肝脏、脾脏、肺、肾等器官组织切片中的分布明显减少，而在肿瘤组织切片中的分布明显增多。
　　结论：
　　FA-PEG-hyd-DOX连接物10%甘露醇冻干粉制剂质地疏松、色泽均匀、成型性好，稳定性高。FA-PEG-hyd-DOX连接物10%甘露醇冻干粉制剂适宜于常温、密封、避光保存。FA-PEG-hyd-DOX连接物增加了 DOX在大鼠血液中的循环时间。FA-PEG-hyd-DOX连接物增加了DOX在荷瘤裸鼠肿瘤组织中的蓄积量，减少了DOX在荷瘤裸鼠正常器官组织的分布，延长了荷瘤裸鼠的生存时间，减轻了DOX的全身毒性，提高了DOX的抗肿瘤活性。

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前言

文献回顾

1 DOX肿瘤靶向制剂的研究概况

2大分子抗肿瘤药物的研究进展

第一部分 FA-PEG-hyd-DOX连接物的合成及表征

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

第二部分 FA-PEG-hyd-DOX连接物及其冻干粉制剂稳定性研究

1材料

2方法

3 结果

4 讨论

第三部分 FA-PEG-hyd-DOX连接物在大鼠体内药物动力学研究

1 材料

2方法

3结果

4 讨论

第四部分 FA-PEG-hyd-DOX连接物体内抗肿瘤活性研究

1 材料

2方法

3 结果

4 讨论

小结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢