仿生纤维内硅化胶原支架材料调控单核细胞促骨原位再生的研究

摘要

近年来，用于骨缺损修复的人工替代材料的研究取得了很大的进展，大量新型的修复材料已在临床上取得了广泛的应用。然而不同的材料由于其理化性能、机械性能以及生物应用性能方面的不同，修复效果差异很大。生物材料在植入体内后，宿主的免疫应答反应是影响其最终应用效果的最重要的因素之一。在早期的研究中，组织修复的研究策略倾向于抑制宿主的免疫应答来提高移植的成功率。而目前普遍接受的观点认为，宿主的免疫应答能够对组织再生修复起到积极的免疫调控作用，从而促进缺损修复以及组织再生。单核细胞是宿主免疫应答调控中的重要细胞，同时也是骨改建以及骨缺损修复进程中不可或缺的关键细胞之一，单核细胞与植入体内的生物材料之间的相互作用也是影响生物材料移植成功的关键因素之一。仿生纤维内硅化胶原支架（SCS），以胶原纤维内部无定形水合二氧化硅有序沉积为特征，是一种具有良好理化性能和机械性能的生物材料。在前期的研究中，这种支架材料，在体外实验中表现出了良好的促进骨再生修复的潜力。然而其在体内应用于骨缺损的修复效果尚不明确，同时宿主免疫系统对其产生的反应目前仍未得到相关的评估。在本研究中，我们对仿生纤维内硅化胶原支架材料在骨缺损修复中的应用进行了全面的生物学评估，验证了其在动物模型上修复骨缺损的效果，并对其与宿主的免疫调控之间的相互作用进行了相关的探索，验证了该支架材料与单核细胞之间的作用，以及通过调控单核细胞来促进组织血管化、种子细胞募集，以及促进骨再生的作用。
　　1.研究思路
　　在第一部分实验中，我们采用胶原纤维模板诱导纳米液相矿物质前体（无定形硅酸）纤维内定向沉积的技术，构建出了仿生纤维内硅化胶原支架，并使用显微CT（Micro-CT）技术和透射电子显微镜（TEM）技术对所构建出的纤维内硅化胶原支架进行了形貌观察；随后对其在体液环境中的硅酸的缓释水平进行了测定。通过小鼠体内异位植入模型对仿生纤维内硅化胶原材料的生物相容性进行了全面的评价：通过淋巴细胞二次刺激增殖实验评价硅化胶原的免疫原性；采用流式细胞技术（Flow Cytometry）评价异位植入的材料对循环淋巴细胞水平以及活性的影响；通过ELISA实验观察异位植入的材料对循环炎症因子水平的影响；通过植入部位组织学切片的HE染色来观察原位炎症细胞的浸润情况，为其进一步用于骨缺损修复提供了实验基础。
　　在第二部分实验中，我们应用纤维内硅化胶原支架修复了小鼠的颅骨缺损，并对其修复效果进行了评估。在植入后即刻、1个月、3个月时采用Micro-CT技术对骨缺损的修复情况、新骨形成量以及骨密度进行了测定；采用贯序荧光标记技术对修复后3个月时的骨改建活性进行了评估；使用修复后3个月时的组织标本制作硬组织切片，采用Van Gieson染色（VG staining）和von Kossa银染（VK sliver staining）技术对切片分别进行染色，在组织学水平观察原位骨再生的情况；在修复后3个月时，采用血管造影技术对缺损原位的血管再生水平进行评估；在修复后1个月时进行组织学切片，通过免疫荧光技术（Immunofluorescence）、免疫组织化学技术（Immunohistochemistry）对缺损部位相关的单核巨噬细胞，以及骨修复过程中的相关细胞因子表达水平进行评估，并采用 TRAP染色（tartrate-resistant acid phosphatase staining）对骨改建活性进行评估。
　　在第三部分实验中，我们通过体外实验进一步对纤维内硅化胶原支架材料对单核细胞的调控作用进行了深入研究。通过细胞增殖实验、凋亡实验、细胞内活性氧水平测定实验来检测支架材料对单核细胞增殖、凋亡、活性氧水平的影响；采用TRAP细胞染色技术来检测支架材料对单核细胞分化的影响；通过细胞免疫荧光染色技术、qRT-PCR技术和Western Blot技术检测支架材料对单核细胞相关细胞因子分泌水平的影响；通过Transwell细胞迁移实验检测支架材料与单核细胞相互作用后对骨髓间充质干细胞（BMSCs）和血管内皮前体细胞（EPCs）迁移的影响；通过Matrigel血管形成实验检测对EPCs成血管能力的影响；通过添加中和抗体来检验支架材料调控单核细胞影响细胞迁移与血管生成的关键细胞因子。
　　在第四部分实验中，我们采用仿生硅化胶原支架材料修复SD大鼠的股骨缺损，进一步对支架材料通过影响单核细胞调控骨再生的信号通路进行了研究。通过显微CT技术、免疫组织化学技术以及Van Geison染色技术对支架材料修复后1个月时，缺损部位的成骨水平，以及血管生成水平进行了评估；采用免疫荧光双标技术对缺损原位的单核细胞以及相关细胞因子的表达水平进行评估；并进一步在体外实验中，采用Western Blot技术对单核细胞相关的分子信号通路进行了检测；采用Western Blot技术、TRAP细胞染色技术以及Transwell细胞迁移实验、Matrigel血管形成实验验证相关信号通路对单核细胞分化和分泌的影响；最后通过体内应用通路抑制剂，来观察相关信号通路阻断后，股骨缺损修复水平的改变。
　　2.实验结果
　　第一部分、仿生纤维内硅化胶原支架的制备与表征
　　1)透射电镜观察下，仿生纤维内硅化胶原支架材料的纤维内部间隙中可见无定形的二氧化硅有序沉积，从而形成明显的带状结构。Micro-CT结果可见仿生纤维内硅化胶原支架为具有多孔隙特征的三维网状纤维支架结构。在模拟体液环境中，材料能够稳定的缓释硅酸，在1-10天时缓释速度较快，10-30天时缓释速度趋于平稳，平均每100mg硅化胶原在10mL PBS中暴露30天后，溶液中的硅酸浓度能达到约1.2mmol/L的水平。
　　2)仿生硅化胶原支架材料的生物相容性评价结果显示：材料具有较低的免疫原性，对淋巴细胞的二次刺激并没有引起明显的增殖反应（p＞0.05）；同时，材料的异位植入对循环淋巴细胞的数量、活性没有影响（p＞0.05），循环中的炎症因子浓度也维持在正常水平（p＞0.05）；原位组织学切片的 HE染色结果显示，硅化胶原支架在植入后7天、14天发生了明显的吸收，材料周围无明显炎症细胞浸润，证明了仿生硅化胶原支架材料具有良好的生物相容性，可以进一步安全地应用于体内骨缺损修复。
　　第二部分、仿生纤维内硅化胶原支架修复小鼠颅骨缺损的体内实验研究
　　1)Micro-CT结果显示仿生纤维内硅化胶原支架材料能够明显的提升小鼠颅骨缺损的修复水平（P＜0.05）。和对照组相比，在术后三个月时，能够观察到形成了更多的新骨，同时其修复后的骨组织的改建活动更加活跃。
　　2)与对照组相比，在术后三个月硅化胶原支架材料修复后的颅骨缺损区域形成了更多的血管组织，其血管长度、厚度、连接性均明显高于对照组（P＜0.05）。
　　3)在术后一个月时，硅化胶原支架材料修复的缺损区域出现了更多的CD31+Endomucin+双阳性的血管，并且有更多的PDGF-BB表达；缺损区域内TRAP阳性的单核细胞数量明显增多，同时单核细胞表达更多的趋化因子SDF-1以及转化生长因子TGF-β1；在硅化胶原支架材料修复后，缺损区域有更多的骨髓间充质干细胞标志物Nestin以及血管内皮生长因子VEGF的表达，提示募集到了更多的修复种子细胞（p均＜0.05）。
　　第三部分、仿生纤维内硅化胶原支架调控单核细胞影响成骨成血管的实验研究
　　1)硅化胶原支架材料对单核细胞的增殖、凋亡和细胞内活性氧水平均没有影响（p＞0.05）；材料自身所缓释的浸提液对BMSCs和EPCs的迁移也没有影响（p＞0.05）。
　　2)硅化胶原支架材料能够促进单核细胞向 TRAP阳性的单核细胞分化（P＜0.05），该类型的单核细胞能够在转录水平和翻译水平表达更多的相关细胞因子（SDF-1，TGF-β，VEGF，PDGF-BB）（p均＜0.05）。
　　3)使用硅化胶原支架材料对单核细胞进行刺激后的条件培养基能够明显的促进BMSCs和EPCs的迁移（P＜0.05），及EPCs的成血管能力（P＜0.05）；中和抗体实验证明条件培养基中的SDF-1，TGF-β和PDGF-BB是促进迁移的关键细胞因子，而TGF-β，VEGF，PDGF-BB则是促进EPCs成血管的关键细胞因子。
　　第四部分、仿生纤维内硅化胶原支架调控单核细胞的信号转导机制研究
　　1)硅化胶原支架材料对不同类型的骨缺损修复均有良好的应用，在大鼠股骨部分缺损的动物模型中，材料能够明显的促进血管与骨的再生（P＜0.05），缺损局部形成了更多的血管结构和更多的小梁骨结构（P＜0.05），表明其具有明显的促进愈合和骨重建的作用；免疫荧光双标的结果显示，缺损区域有更多的CD31+Emcn+双阳性的血管生成（P＜0.05），同时表达更多的TRAP+的单核细胞（P＜0.05），单核细胞的PDGF-BB分泌也明显增多（P＜0.05）。
　　2)在体外实验中，硅化胶原支架材料刺激后，单核细胞的P38和ERK1/2被激活；使用通路抑制剂分别抑制P38和ERK1/2后，发现单核细胞向TRAP阳性细胞的分化和相关细胞因子（SDF-1，TGF-β，VEGF，PDGF-BB）的分泌水平明显下降（P＜0.05），其与支架材料共培养后的条件培养基促进细胞迁移和EPCs成血管的能力也明显下降（P＜0.05）；进一步的体内实验研究表明，在P38抑制后，大鼠股骨缺损局部形成的CD31+Emcn+双阳性的血管明显减少（P＜0.05），TRAP阳性单核细胞的数目以及单核细胞表达PDGF-BB的水平也明显降低（p均＜0.05），表明硅化胶原支架材料能够通过激活 P38信号通路来进一步促进单核细胞的分化和分泌能力，从而影响骨缺损修复的进程。
　　3.结论
　　1)仿生纤维内硅化胶原支架材料表现出了低免疫原性的特征，能够使宿主的免疫炎症反应控制在较低的水平范围内，并且不会引起局部组织的炎症细胞浸润以及循环炎症细胞和炎症因子的上升，具有良好的生物相容性，在生物应用方面具有明显的优势。
　　2)纤维内仿生硅化胶原支架能够应用于不同类型的骨缺损修复（小鼠颅骨缺损，大鼠股骨部分缺损），可以促进缺损局部的血管再生和骨重建，具有良好的骨缺损修复效果。
　　3)在骨缺损的修复早期，仿生纤维内硅化胶原支架材料能够通过对单核细胞P38信号通路的激活，促进单核细胞向TRAP阳性单核细胞分化，分泌更多的相关细胞因子（SDF-1，TGF-β，VEGF，PDGF-BB）；一方面能够促进局部的血管生成，尤其是形成更多的CD31+Emcn+双阳性血管，更好的促进成骨成血管的协同作用（Coupling），另一方面能够募集更多的宿主种子细胞（BMSCs，EPCs）到缺损区域，从而进一步促进局部的血管生成和骨再生。
　　综上所述，仿生纤维内硅化胶原支架材料具有良好的生物相容性，在动物骨缺损模型的修复中表现出了良好的修复效果，能够明显促进缺损局部的血管化和骨生成；仿生纤维内硅化胶原支架材料能够通过对单核细胞的调控，在修复早期促进单核细胞的分化和分泌功能，从而进一步促进局部的血管化和宿主种子细胞的募集，与传统的骨修复材料需要额外加载种子细胞或者细胞因子相比，在应用方面具有便捷性和明显的优势，在骨组织的再生修复的应用中具有明显的转化潜力和应用前景。

目录

声明

缩略语表

前言

文 献 回 顾

1 生物材料在骨缺损修复中的应用研究进展

2 免疫系统与生物材料的相互作用

第一部分 仿生纤维内硅化胶原支架的制备与表征

实验一 仿生纤维内硅化胶原支架的形貌特征与缓释性能

实验二 仿生纤维内硅化胶原支架的生物相容性评价

第二部分 仿生纤维内硅化胶原支架修复小鼠颅骨缺损的体内实验研究

实验三 仿生纤维内硅化胶原支架促骨缺损修复的实验研究

实验四 仿生纤维内硅化胶原支架促血管新生的实验研究

实验五 仿生纤维内硅化胶原支架材料参与宿主免疫应答反应的实验研究

第三部分 仿生纤维内硅化胶原支架调控单核细胞影响成骨成血管的实验研究

实验六 仿生纤维内硅化胶原支架对单核细胞增殖、凋亡及细胞内活性氧的影响

实验七 仿生纤维内硅化胶原支架对单核细胞分化以及分泌功能的影响

实验八 仿生纤维内硅化胶原支架调控单核细胞促进细胞归巢和血管生成的体外实验研究

第四部分 仿生纤维内硅化胶原支架调控单核细胞的信号转导机制研究

实验九 仿生纤维内硅化胶原支架对单核细胞调控的信号转导机制研究

实验十 仿生纤维内硅化胶原支架促大鼠股骨缺损血管化和骨再生的实验研究

实验十一 仿生纤维内硅化胶原支架调控单核细胞促进大鼠股骨缺损修复的机制研究

小结

参考文献

附录

1 实验仪器

个人简历和研究成果

致谢