一种直观在体反映HCV RdRp酶活性的新型转基因小鼠模型的建立

摘要

【背景】
　　丙型肝炎病毒（Hepatitis C virus，HCV）属于黄病毒科（Flaviviridae）肝炎病毒属（Hepacivirus），是引起人类慢性肝炎、肝硬化，甚至肝癌的重要病原体之一。HCV感染呈全球化流行，目前约有1.7亿感染者，尚无有效的预防疫苗。HCV为单股正链RNA病毒，基因组全长约9.6Kb，由一个开放阅读框(open reading frame，ORF)、5′非编码区（untranslated region，UTR）和3′UTR构成，5′UTR和3′UTR是RNA复制与翻译过程中重要的调控元件。ORF编码一个约由3000个氨基酸组成的多聚蛋白前体，多聚蛋白前体在宿主信号肽酶和病毒蛋白酶共同作用下被加工为10个成熟的病毒蛋白，包括3个结构蛋白（核心蛋白、包膜糖蛋白E1和E2）和7个非结构蛋白（p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B）。研究证实，NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B主要参与病毒RNA的复制，其中NS5B具有RNA依赖的RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase，RdRp）活性，在RNA复制过程中发挥最关键的作用，被认为是抗HCV治疗的关键靶点。
　　目前，针对NS5B靶点的药物Sofosbuvir已被批准上市，临床疗效显著，证实了NS5B是抗 HCV治疗的理想靶点，但该药价格极其昂贵，难以被推广应用。NS5B抑制剂研发进展缓慢，主要原因是由于缺乏抑制剂评价的实验系统。随着对 HCV RNA复制机制的深入研究，利用RNA病毒的反向遗传技术构建了两端含有HCV5′UTR和3′UTR、中间为报告基因序列的HCV微小基因组系统。细胞实验已证实了该系统可以模拟HCV RNA的复制，为RdRp酶活性评价提供了有效的工具。然而体外实验缺乏细胞之间的相互作用，不能真实的反映 HCV感染时机体内复杂环境下RdRp酶的活性。与细胞实验相比，在体研究能够更加真实的模拟人体内环境。因此，建立一种能够反映HCV RdRp酶活性的动物模型，可以为HCV抑制剂的研发提供更加有效的实验评价平台。
　　【目的】
　　利用眼底静脉丛水动力基因转染技术建立一种直观在体反映HCV RdRp酶活性的新型转基因小鼠动物模型。
　　【方法】
　　质粒pIRES2-EGFP-NS3-5B经酶切线性化，通过受精卵显微注射技术制备HCV NS3-5B转基因首建鼠，PCR鉴定转基因首建鼠。转基因首建鼠与 C57BL/6小鼠杂交，经PCR、RT-PCR和Western blot鉴定子代小鼠，子代阳性小鼠继续与C57BL/6小鼠杂交，直到筛选出遗传性状稳定的HCV NS3-5B转基因小鼠。
　　眼球采血分离血清，测定血清转氨酶ALT和AST，以C57BL/6小鼠血清测定指标作为对照，分析HCV NS3-5B转基因小鼠血清转氨酶ALT和AST是否发生明显变化；通过肝、肾、脾组织HE染色分析NS3-5B转基因小鼠组织形态改变。
　　根据HCV微小基因组和HDV核酸酶基因序列，设计用于扩增含有HDV核酸酶序列的A片段和B片段的引物，以质粒pcDNA3.1(+)-(-)3UIRrG(-)5为模板，利用重叠延伸PCR分别扩增A和B片段，酶切克隆到载体质粒pcDNA3.1(+)-MCS，构建重组质粒pcDNA3.1(+)-H0299G，经PCR、酶切、测序鉴定。
　　利用眼底静脉丛水动力基因转染技术将pcDNA3.1(+)-H0299G转染NS3-5B转基因小鼠，通过 Western blot、单个组织器官活体成像和免疫组织化学染色检测 GLuc在小鼠组织中的表达；通过血清ALT和AST检测以及肝组织HE染色评估小鼠肝组织的损伤。此外，利用化学发光原理对小鼠血浆中GLuc的表达量和在体发光强度进行检测。
　　【结果】
　　质粒pIRES2-EGFP-NS3-5B酶切产物经电泳分离鉴定，获得了预期大小的NS3-5B转基因载体片段；NS3-5B转基因首建鼠经PCR扩增鉴定，获得了预期大小的目的基因条带。
　　NS3-5B转基因首建鼠与C57BL/6小鼠杂交，子代小鼠经PCR、RT-PCR、Western blot鉴定获得预期大小的目的条带，经连续杂交鉴定筛选出遗传性状稳定的NS3-5B转基因小鼠。与C57BL/6小鼠相比，NS3-5B转基因小鼠血清ALT、AST以及组织HE染色均未发现有明显病理形态改变。
　　Western blot、组织器官活体成像和免疫组织化学染色证实眼底静脉丛水动力基因转染技术具有肝组织特异性转染效果，经血清转氨酶ALT和AST检测以及肝组织HE染色显示该技术只对小鼠肝组织造成短暂性的物理损伤，但这种损伤机体可以自行修复，不会对其正常生理功能造成影响。
　　质粒pcDNA3.1(+)-H0299G在体转染后，与C57BL/6小鼠相比，NS3-5B转基因小鼠血清GLuc实时监测以及动态活体荧光成像均发现GLuc表达显著，表明HCV微小基因组在NS3-5B转基因小鼠体内可以复制并表达GLuc。
　　【结论】
　　本研究成功构建了表达HCV复制复合体的NS3-5B转基因小鼠模型。通过眼底静脉丛水动力转染质粒pcDNA3.1(+)-H0299G于NS3-5B转基因小鼠，转染小鼠体内GLuc表达证实HCV微小基因组在HCV RdRp酶介导下可以在体表达。该新型转基因小鼠模型的建立实现了直观在体评价HCV RdRp酶的活性，为HCV NS5B抑制剂的评价和筛选提供了实验平台。

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缩略语表

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前言

文献回顾

第一部分 丙型肝炎病毒NS3-5B转基因小鼠模型的制备

1 实验材料

2 实验方法

3 实验结果

4 讨论

第二部分 丙型肝炎病毒微小基因组系统在体直观评价HCV RdRp酶的活性

1 实验材料

2 实验方法

3 实验结果

4 讨论

小结

一、制备了稳定表达HCV NS3-5B的转基因小鼠模型

二、证实了眼底静脉丛水动力基因转染技术的实用性

三、构建了重组质粒pcDNA3.1(+)-H0299G

四、建立了直观在体反映HCV RdRp酶活性的新型转基因小鼠模型

参考文献

个人简历和研究成果

致谢