他克莫司对实验性自身免疫性肌炎小鼠中CD4+T淋巴细胞亚群的影响

摘要

特发性炎症性肌病（idiopathic inflammatory myopathies, IIMs）是一组以骨骼肌炎性细胞浸润、肌无力、肌疲劳为特征的一组疾病,根据不同的临床和病理学特征，可以分为以下几类：多发性肌炎、皮肌炎、包涵体肌炎、坏死性肌炎。免疫细胞介导的肌纤维损伤、肌炎特异性和肌炎相关抗体的存在及骨骼肌MHC-Ⅰ分子的过表达充分说明该疾病是一种免疫介导的疾病。
　　免疫组织化学研究表明，患者肌肉组织有大量炎性细胞浸润，主要为巨噬细胞和CD8+、CD4+T细胞。Th1和Th17细胞是CD4+T细胞的亚群，二者在多发性硬化、类风湿性关节炎等多种自身免疫性疾病发生发展中有关键作用。肌炎患者血清TNF、IFN-γ、IL-12的升高提示Th1介导了该类疾病的发生。最近研究描述了Th17相关因子如IL-17、IL-22、IL-6在肌炎患者的过度表达，突出了Th17在肌炎发病中的作用。Treg细胞是具有免疫抑制功能的、CD4+T细胞的另一个亚群，是维持机体免疫稳态和免疫耐受的重要细胞。一般情况下，三者处于一种动态平衡。免疫稳态的打破，如Treg功能缺失，Th1、Th17等效应T细胞过度增殖，常导致炎症和多种自身免疫性疾病的发生发展。
　　目前IIMs确切病因及致病机制不明，临床上多采用糖皮质激素的对症治疗，长时间应用副作用大、效果并不理想。他克莫司（tacrolimus, Tac）是从链霉菌属中提取的大环内酯类化合物，是一种钙调磷酸酶抑制剂，通过抑制磷酸酶的活化下调IL-2水平，进而抑制T淋巴细胞的增殖。Tac作为一种新型强效免疫抑制剂，已被应用于类风湿性关节炎、炎症性肠病等自身免疫性疾病并显示出良好的治疗作用。那么， Tac对IIMs的作用及对肌炎中Th1、Th17、Treg细胞的影响如何，尚未有明确报道。本研究拟通过Tac干预实验性自身免疫性肌炎（experimental autoimmune myositis， EAM）小鼠，检测小鼠中Th1、Th17、Treg细胞及其相关细胞因子的变化，观察Tac对肌炎小鼠中三种CD4+T细胞亚群的影响，探讨Tac的可能治疗作用。
　　目的：
　　观察Tac对肌炎小鼠Th1细胞及IFN-γ、Th17细胞及IL-17A、Treg细胞及Foxp3的影响，评估Tac对EAM小鼠的治疗效果，为IIMs的治疗提供实验基础。
　　方法：
　　实验一 Tac对EAM小鼠的治疗作用
　　15只雌性BALB/c小鼠随机分为正常对照组、EAM模型组、Tac干预组。连续14天药物干预后，分别观察各组小鼠一般状态，测量各组小鼠肌力；HE染色观察三组小鼠肌纤维损伤及炎细胞浸润情况；RT-PCR检测肌肉组织 IL-1β、IL-6、IL-23 mRNA表达水平；液相芯片技术检测三组小鼠血清IL-1β、IL-6水平。
　　实验二 Tac对EAM小鼠Th1、Th17、Treg细胞的影响
　　分离小鼠脾脏淋巴细胞，按106/ml接种于96孔培养板，分别给予不同浓度Tac干预，采用CCK8法检测Tac对脾细胞增殖的影响；PMA、Ionomycin刺激脾脏淋巴细胞活化，FACS检测CD4+T细胞表面CD25、CD69的表达，观察不同剂量Tac对CD4+T细胞活化的影响；FACS检测三组小鼠脾脏中Th1、Th17、Treg细胞的数量；RT-PCR检测小鼠脾脏IFN-γ、IL-17A、Foxp3 mRNA及IL-12、IL-23 mRNA表达水平；液相芯片技术检测三组小鼠血清IFN-γ、IL-17A水平。
　　结果：
　　实验一正常组小鼠肌力较好，时间都大于1800s，EAM组小鼠肌力大幅度下降，为150.2±17.31s，与EAM组相比，Tac干预组肌力明显回升，为245.8±14.02s（P＜0.05）；HE染色可见大量炎细胞浸润EAM小鼠肌肉组织，Tac干预组与EAM组相比，炎细胞明显减少；三组小鼠肌肉组织学评分分别为0、2.38±0.17、1.76±0.15（P＜0.05 EAM组 vs正常组；P＜0.05 Tac组 vs EAM组）；三组小鼠肌肉组织 IL-1β、IL-6、IL-23mRNA表达情况：与正常组小鼠相比，EAM小鼠肌肉组织IL-1β、IL-6、IL-23 mRNA表达水平均显著升高（IL-1β：1.03±0.29 vs3.18±0.41，IL-6：1.01±0.16 vs2.77±0.36，IL-23：1.02±0.23 vs2.85±0.54），三者表达水平在Tac干预组小鼠有明显下降（分别为2.34±0.37、1.99±0.40、1.89±0.34），与EAM组相比，差异均有统计学意义（P＜0.05）；正常组小鼠血清中IL-1β、IL-6水平较低，分别为4.64±1.68pg/ml，17.92±5.61pg/ml，EAM组可见有大幅度升高（IL-1β：34.54±4.10pg/ml，IL-6：170.71±21.93pg/ml），而Tac干预组二者浓度虽仍然比较高，但相比较EAM组，下降明显（IL-1β：23.89±5.14pg/ml，IL-6：77.51±14.03pg/ml），差异有统计学意义（P＜0.05）。
　　实验二 Tac可明显抑制脾淋巴细胞增殖，且呈一定的剂量依赖性。Tac可显著减少CD4+T淋巴表面CD25、CD69表达：正常组、Tac干预组（低、中、高剂量组）CD4+T淋巴细胞CD25表达率分别为75.56±4.92％，22.83±4.13%，15.77±4.21%，10.63±2.77%；CD69表达率分别为73.92±4.33%，48.13±3.95%，43.44±2.66%，40.40±3.11%。与正常组相比，EAM组小鼠脾脏Th1、Th17、Treg细胞显著增多（Th1：0.97±0.33% vs3.24±1.39%，Th17：0.51±0.09%vs1.47±0.47%，Treg：1.47±0.21%vs3.27±0.90%）， Tac干预组三者均有不同程度下降（Th1：1.52±0.24%，Th17：0.82±0.07%，Treg：1.87±0.15%），差异有统计学意义（P＜0.05）。三组小鼠脾脏IFN-γ、IL-17A、Foxp3 mRNA的变化趋势与各自的细胞一致：与正常组相比，EAM组显著升高，Tac干预组均有不同程度回落（IFN-γ：1.03±0.28，3.41±0.49，2.34±0.63；IL-17A：1.00±0.09，2.78±0.62，2.04±0.30；Foxp3：1.04±0.24，1.73±0.28，1.19±0.24）。正常组小鼠血清IFN-γ较低，为2.14±0.55pg/ml，EAM组小鼠该因子水平较正常组增长了10倍之多（23.56±5.22pg/ml），Tac干预组可见显著下降（16.10±3.16pg/ml）。血清 IL-17A变化趋势同IFN-γ，EAM组最高，约为正常组的9倍，Tac组较EAM组明显下降（三组浓度分别为：10.77±4.27pg/ml，91.97±27.52pg/ml，43.37±16.81pg/ml）。与正常组相比，模型组小鼠脾脏 IL-12、IL-23mRNA水平显著升高（ IL-12：0.96±0.09 vs3.01±0.82，IL-23：1.06±0.19 vs2.10±0.42），Tac干预后，二者均明显下调（分别为1.67±0.49，1.50±0.19），差异有统计学意义（P＜0.05）。
　　结论：
　　1．Tac可改善肌炎小鼠肌力，减轻肌肉组织炎症。Tac干预后，肌炎小鼠肌肉组织炎性因子IL-1β、IL-6、IL-23 mRNA表达水平明显降低，血清IL-1β、IL-6水平也明显降低，提示Tac对EAM小鼠有明显的治疗效果。
　　2．Tac对脾脏淋巴细胞增殖具有明显抑制作用，且呈一定的剂量依赖性；Tac对CD4+T淋巴细胞活化有明显抑制作用。
　　3．Tac可降低EAM小鼠中Th1、Th17数量，但没有增加Treg细胞数量；Tac可下调肌炎小鼠中 IL-12、IL-23 mRNA表达水平。综上提示，Tac可能通过影响IL-12/Th1、IL-23/Th17炎症轴，发挥对肌炎小鼠的保护作用。其具体机制尚需进一步验证。

目录

声明

缩略语表

前言

文献回顾

1特发性炎症性肌病

2 CD4+T淋巴细胞亚群概述

3他克莫司

实验一 他克莫司对实验性自身免疫性肌炎小鼠的治疗作用

1材料

2方法

3结果

4 讨论

实验二 他克莫司对肌炎小鼠中Th1、Th17、Treg细胞的影响

1材料

2方法

3结果

4讨论

小结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢