DDR2在肺纤维化中的作用及与TGF-β相互作用关系研究

摘要

肺纤维化（pulmonary fibrosis,PF）是多种弥漫性间质性肺疾病共同的结局，找不到明确诱因也是最常见的肺纤维化类型被称为特发性肺纤维化（idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）。由于缺乏灵敏的早期诊断及有效的治疗手段，大多IPF患者在确诊后的3～5年死于呼吸衰竭。因此，IPF风险标志物的寻找及相关靶向药物的研发一直是世界范围内的热点和难点。以胶原为主要组分的细胞外基质（ECM）的过度沉积是纤维化疾病的典型病理特征。近年的研究显示，ECM不仅仅是纤维化反应的产物，更是疾病进展的重要推动者。哺乳动物细胞膜表面介导胶原信号的受体主要有整合素（integrins）家族的4个成员和盘状结构域受体（discoidin domain receptors,包括DDR1和DDR2）。我们课题组最新发表的研究揭示：DDR2存在激酶活性依赖和非依赖两种促肺纤维化模式；抑制DDR2的表达或其激酶活性可阻止肺纤维化的持续进展。基于以上研究基础，我们提出如下科学问题：①DDR2与肺纤维化的相关性是否具有临床意义？②DDR2激酶活性非依赖促肺纤维化的分子机制是什么？③具有自主知识产权的DDRs小分子抑制是否也能用于治疗肺纤维化？针对上述问题，我们进行了如下三方面的研究：
　　研究一、肺纤维化临床标本中六种胶原受体表达情况研究
　　鉴于其他胶原受体成员亦有与肺纤维化相关的研究报道，我们在本研究中对6种胶原受体（α1β1、α2β1、α10β1、α11β1、DDR1、DDR2）在肺纤维化临床病理标本中的表达状态进行了同步检测分析。实时荧光定量PCR结果显示，DDR2在IPF患者肺组织中的表达量显著高于健康人肺组织，而其他5种胶原受体的表达则呈现变化不显著或无变化的趋势。此外，DDR2的表达量在非特发性肺纤维化中也呈现显著的上调。DDR2在肺纤维化临床标本中的高表达也在蛋白质水平得到了验证。组织化学免疫染色来进一步确定DDR2在肺纤维化相关疾病中的细胞定位情况。这部分具有显著临床意义的研究不仅明确了DDR2在晚期IPF进展中的主导性地位，也提示其可作为IPF病情评估的标志物及治疗的靶点。
　　研究二、DDR2与TGF-β通路交互作用机制探索
　　转化生长因子-β（TGF-β）被认为是最强力的促纤维化因子，抑制TGF-β活化的抗体类药物也已进入IPF的II期临床实验中。然而，TGF-β也是最为多效的细胞因子，其下游经典的Smad通路除了参与很多疾病的进展之外，还参与维持很多细胞正常的功能。因此，非选择性地阻断TGF-β信号通路具有导致癌变和免疫抑制等风险。我们课题组之前的研究显示，DDR2基因缺失会影响肺成纤维细胞对TGF-β刺激的应答，本部分研究旨在深入探索DDR2与TGF-β通路交互作用的机制。结果显示，DDR2的表达缺失不影响经典的Smad通路的活化，但却显著抑制p38和Akt通路的激活，且证实DDR2对TGF-β非经典通路活化的影响不依赖于胶原诱导的DDR2的酪氨酸磷酸化。那么，DDR2是否可能通过与其他蛋白质的相互作用来施加对TGF-β通路的影响呢？我们进一步通过免疫沉淀/质谱的方法初步探寻了TGF-β刺激条件下DDR2的相互作用蛋白质，并得到了初步的进展。
　　研究三、DDR2小分子抑制剂GZD856与6j的抗纤维化效果
　　虽然炎症反应在纤维化的起始过程中发挥着重要的作用，但临床实践已证实抗炎治疗无法阻止肺纤维化的持续进展。IPF患者待通过高分辨率CT确诊时病情往往已发展到中晚期，这一阶段患者肺组织最主要的病理特征是出现散在的纤维灶或由纤维灶融合形成的网状、蜂窝状改变。鉴于第一部分研究已经明确了DDR2在晚期纤维化中的主导性地位，我们推测“胶原刺激—DDR2活化—胶原合成”这一正反馈通路可能是中晚期肺纤维化持续进展的重要推动力，而靶向DDR2激酶活性的小分子抑制剂则有可能抑制这一病理过程。本部分实验中，我们通过博来霉素诱导的肺纤维化小鼠模型以及细胞水平实验，分别测试了两种DDR2小分子抑制剂的效果。结果显示，6j抑制剂在小鼠模型中有较为显著的效果，通过HE与Masson染色，以及羟脯氨酸含量测定显示了该抑制剂在动物模型中的作用；而GZD856在细胞水平上有显著作用，通过免疫印迹的检测，我们发现该抑制剂在较小剂量下，就可以对DDR2的磷酸化和TAK1的磷酸化有显著的抑制作用，结合之前的动物实验可以表明，该抑制剂对小鼠肺纤维化进程以及相关分子作用的阻断中起到一定作用。

目录

声明

缩略语表

前言

文献回顾

第一部分 盘状结构域受体（discoidin domain receptors， DDRs）的研究进展

一、 DDRs的概况

二、 DDRs的结构、功能和调节

第二部分 特发性肺纤维化研究进展

一、特发性肺纤维化的概况

二、特发性肺纤维化的病理学特点

第一部分 整合素和DDRs家族成员在肺纤维化临床标本中的表达状态研究

1. 实验材料

1.1检测用临床标本

1.2 主要试剂

1.3 主要仪器

2. 主要实验方法

2.1 TRIzol法提取标本中的RNA和蛋白质

2.2 实时定量PCR检测组织标本中的各种RNA含量

2.3 蛋白质免疫印迹实验（Western bloting）

2.4 免疫组织化学染色（Immunohistochemistry）

3．实验结果

3.1 特发性肺纤维化（IPF）患者组织中胶原受体类整合素的mRNA水平分析

3.2 不同类型肺纤维化患者组织中DDR1和DDR2的mRNA水平分析

3.3 三种不同类型肺纤维化患者组织中的DDR2蛋白质水平分析

3.3 不同肺纤维化疾病组织中DDR2的细胞分布及其激活状态分析

4． 讨论

第二部分 肺纤维化发展中DDR2与TGF-β通路的相互作用研究

1． 实验材料

1.1实验动物

1.2主要试剂

1.4 主要仪器设备

2. 实验方法

2.1纯合型Ddr2小鼠培育及基因型鉴定

2.2 肺成纤维细胞原代培养

2.3 免疫印迹（Western bloting）

2.4 免疫沉淀（immunoprecipitation IP）

2.5 质谱分析以及相互作用蛋白质的预测

2.6 博来霉素诱导小鼠肺纤维化模型制备

2.7 DDR2慢病毒包装与制备

2.8 慢病毒感染细胞

2.9 胶原和TGF-β处理细胞

3. 实验结果

3.1 DDR2对TGF-β通路的影响可能不依赖其活化状态

3.2 DDR2在小鼠体内活化TGF-β通路

3.3 DDR2是TGF-β通路增强促血管新生因子表达的调控分子

3.4 对DDR2的相互作用分子的初步筛选

4. 讨论

第三部分 DDR2小分子抑制剂GZD856和6j的抗纤维化效果

1. 实验材料

1.1 实验对象

1.2 主要试剂

1.4 抗体

1.4 主要仪器

2. 实验方法

2.1博来霉素诱导的小鼠肺纤维化模型的药物模拟治疗

2.2 蛋白质免疫印迹

2.3 新鲜肺组织的获取及固定

2.4 HE染色（苏木精-伊红染色）

2.5 Masson染色

2.6 细胞培养及药物处理

3. 实验结果

3.1 GZD856抑制剂对于DDR2的抑制作用

3.2 DDR2抑制剂6j对博来霉素诱导小鼠肺纤维化的治疗作用

4． 讨论

小结

研究成果

参考文献

个人简历和研究成果

致谢