乙肝病毒基因突变与基因组多样性和疾病关联性研究

摘要

在我国，HBV慢性感染是导致肝硬化、肝癌发生的重要诱因。研究发现HBV的基因型可能与疾病的临床表现密切相关，而HBV基因的突变与肝炎的治疗失败和肝癌的发生密切相关。因此，通过对乙肝患者进行HBV基因分型及肿瘤相关基因突变检测，将有助于HBV感染相关肝病的个体化治疗的指导和疾病转归的预警。在前期研究中，本课题组研发了包含HBV基因特异性扩增、HBV基因分型软件和HBV基因突变分析软件的乙型病毒性肝炎个体化检测平台，应用该平台扩增并分析乙肝患者血清、组织样本中HBV基因组序列，可以实现HBV基因分型和基因突变的分析，并已取得相关知识产权。同时，在病例研究中我们发现了与基因型相关的特异性突变位点：RT区rt169和rt180位点和BCP区1799位点。然而在应用该个体化检测平台进行大样本量检测的过程中遇到了基因扩增稳定性不足、部分DNA序列难以解读、软件兼容性问题等，因此本课题拟依据生物信息学原理优化升级乙型病毒性肝炎个体化检测平台，探索DNA测序失败的原因，并使用优化的平台进一步研究逆转录酶区rt169、rt180位点和基本核心启动子区1799位点突变在肝癌发生中的意义。
　　第一部分：乙型病毒性肝炎个体化检测平台优化升级
　　目的：解决乙型病毒性肝炎个体化检测平台在大样本量检测过程中遇到的扩增稳定性不足和软件兼容性问题。
　　方法：采用生物信息学方法筛选符合中国地区HBV流行株特点的标准序列，序列分析确定基因分型和基因型耐药检测的共用序列，设计相应的扩增引物。通过多序列比对确定型特异性SNP位点，据此设计基因分型算法，将HBV基因分型和基因突变分析功能整合至新软件中。使用新软件和Genotyping tool软件对GenBank收录的中国人群感染的HBV的DNA序列进行基因分型分析。
　　结果：分析获得了HBV基因分型和基因型耐药检测功能共用序列，成功设计了相关基因扩增引物；HBV基因分型和基因突变分析功能整合至新软件HBVAnalyzer；HBVAnalyzer和Genotyping tool基因分型结果一致。
　　第二部分：乙肝病毒逆转录酶区突变分析
　　目的：了解HBV基因型与核苷（酸）类似物耐药以及肝癌的关系，并探究rt169和rt180位点突变与肝癌发生的关系。
　　方法：用优化升级后的扩增引物和乙型病毒性肝炎个体化检测平台对一组191例肝癌患者手术切除组织样本进行HBV RT区PCR扩增、DNA测序、基因分型和基因型耐药的检测分析。
　　结果：从191例样本中成功扩增了190例HBV RT区片段，基因分型结果显示本研究中肝癌患者感染的HBV以C基因型为主（71.01％），B基因型次之（28.40%）。前期研究发现LC/HCC组 B基因型 HBV感染者rt169和 rt180位点存在较高比例的天然同义突变，本实验组HCC病人该位点突变率分别高达95.83%和100%。测序峰图显示rt169和rt180主要为杂合突变型（78.21%），与前期研究中LC/HCC组比较，两组中杂合突变型比例相似；与前期研究中CHB组比较，杂合突变型比例显著增加（P＜0.01）。证明在疾病转化过程中，B基因型HBV rt169和 rt180位点突变与病情发展具有相关性，可能成为预测疾病进展的新的标志物。
　　第三部分：乙肝病毒BCP/Pre C区基因序列常见突变与基因突变多样性分析
　　目的：解析HBV BCP/Pre C区序列难以解读的原因和解决办法，揭示HBV BCP/Pre C区序列复杂突变与HBV基因组多样性的关系，进一步探究前期发现的HBV B型特异性新突变1799G>C与肝癌的关系。
　　方法：采用构建DNA文库和单克隆测序的方法对直接测序失败的21例病人样本的HBVBCP/Pre C区序列进行了深度测序分析；用优化升级后的乙型病毒性肝炎个体化检测平台对病人肝癌组织样本中HBVBCP/Pre C区序列进行基因突变检测分析。
　　结果：对21例PCR测序失败的样本进行PCR产物克隆测序，发现HCC病人感染的HBV病毒的BCP/Pre C区序列突变多达144种，包含20种缺失突变和7种插入突变，其中△nt1757-1765和△nt1824-1832位点的高频联合缺失突变为首次发现；每一例样本的突变至少包含6种，说明HCC病人体内HBV基因组BCP/Pre C区序列多样性是是由基因组的复杂突变产生的，揭示了复杂突变是导致直接测序结果无法判读的原因。
　　针对G1799C型特异性突变的研究显示，本组HCC病人中B基因型者G1799C突变率为85.71%。与前期发现的结果吻合；进一步分析显示G1799C突变常与A1762T/G1764A/G1896A/G1899A联合发生，而后者与HBeAg假性转阴和肝损伤程度加重有关。因此我们认为B基因型HBV的G1799C突变与HBV病毒复制能力增强、HBeAg表达水平降低、肝损伤的程度加重有关。

目录

声明

缩略语表

前言

文献回顾

1. 乙型肝炎病毒的流行病学

2. 乙肝病毒的复制

3. HBV的结构

4. HBV的基因型

5. HBV的耐药

6. HBVBCP/Pre C区突变与病情发展的关系

第一部分 乙型病毒性肝炎个体化检测平台优化升级

1 材料

2 方法

3结果

4 讨论

第二部分 乙肝病毒逆转录酶基因突变分析

1 材料和仪器

2 实验方法

3 结果

4 讨论

第三部分乙肝病毒BCP/Pre C区基因序列常见突变与基因突变多样性分析

1 材料和仪器

2 实验方法

3 结果

4 讨论

小结

参考文献

研究成果

致谢