DUSP1在人正常及骨关节炎滑膜细胞中的表达及对骨关节炎的保护作用

摘要

骨关节炎（OA）是一种常见的关节疾病之一，也是导致中老年人关节功能障碍的主要原因。长期以来，骨关节炎都被认为是一种典型的非炎症性关节病，但近年来的研究证实，炎症对骨关节的症状及进展起到了非常重要的作用，骨关节炎是一种炎症相关性疾病这一概念已被普遍接受。因此，针对骨关节炎炎症过程进行干预可能是一种治疗及预防骨关节炎的有效手段。
　　双特异性磷酸酶1（DUSP1），也被称为丝裂原活化蛋白激酶磷酸酶1（MKP1），能够通过对丝裂原活化蛋白激酶中特异性酪氨酸/苏氨酸残基的去磷酸化作用而抑制其活性，是细胞中MAPK信号通路的重要抑制因子。大量研究表明，DUSP1是炎症反应中重要的负性调控因子，而诱导DUSP1表达可能是一种潜在的新型抗炎方法。
　　本研究首先检测了 DUSP1在人正常及骨关节成纤维样滑膜细胞中的表达差异，并进一步探明其作用机制，证实 DUSP1通过抑制细胞中 p38MAPK及 JNK信号通路抑制MMP-13、COX-2等骨关节炎相关效应分子的表达，从而在骨关节炎过程中发挥保护性作用。同时，在研究中我们也证实糖皮质激素地塞米松能够诱导人骨关节炎成纤维样滑膜细胞中DUSP1的表达，并推测地塞米松的抗炎作用可能是部分通过诱导 DUSP1表达来实现。因此，DUSP1有望成为治疗及预防骨关节炎新的潜在的作用靶点。
　　目的:
　　1．对人正常及骨关节炎成纤维样滑膜细胞进行体外培养及鉴定；
　　2．探索DUSP1在人正常及骨关节炎成纤维样滑膜细胞中的表达差异；
　　3．证实地塞米松对人骨关节炎成纤维样滑膜细胞中DUSP1的诱导表达作用及对p38MAPK、JNK通路和骨关节炎效应分子MMP-13、COX-2表达的抑制作用；
　　4．构建DUSP1过表达慢病毒载体；
　　5．明确DUSP1通过抑制 p38MAPK、JNK信号通路而抑制骨关节炎相关分子的表达，从而在骨关节炎中发挥保护性作用。
　　方法:
　　1．采用酶消化法体外培养人正常及骨关节炎成纤维样滑膜细胞并传代， CCK-8法检测细胞增殖活性，并通过流式细胞术对细胞 CD55分子表达进行检测鉴定并测定细胞纯度，以满足后续实验要求；
　　2．采用实时荧光定量 PCR、Western blot、细胞免疫荧光染色检测人正常及骨关节炎成纤维样滑膜细胞和地塞米松诱导的人骨关节炎成纤维样滑膜细胞中DUSP1的表达；
　　3．采用Western blot、实时荧光定量PCR方法对上述各组细胞中p38MAPK、JNK信号通路活化情况及骨关节炎相关效应分子MMP-13、COX-2的表达进行检测；
　　4．采用分子生物学技术构建DUSP1过表达慢病毒载体LV-DUSP1并用PCR、Western blot方法进行鉴定；
　　5．用LV-DUSP1感染人成纤维样滑膜细胞，探索感染条件并观察感染效率，用Western blot方法检测感染后DUSP1表达；
　　6．采用Western blot检测感染后人骨关节炎成纤维样滑膜细胞中p38MAPK、JNK通路的活化情况及相关效应分子表达的变化，并用CCK-8法检测感染后细胞增殖活性变化。
　　结果:
　　1．流式细胞术检测显示，培养细胞中CD55阳性率达到98.3％，符合成纤维样滑膜细胞特征，细胞纯度达到后续实验要求；
　　2．CCK-8实验显示骨关节炎成纤维样滑膜细胞的增殖速度明显高于正常滑膜细胞；
　　3．实时荧光定量PCR、Western blot、细胞免疫荧光染色结果表明，人骨关节炎成纤维样滑膜细胞中DUSP1表达明显受到抑制，地塞米松能够诱导人骨关节炎成纤维样滑膜细胞中DUSP1表达；
　　4．Western blot、实时荧光定量PCR结果显示地塞米松能够抑制p38MAPK、JNK信号通路活化及MMP-13、COX-2的表达；
　　5．PCR、Western blot结果表明过表达DUSP1慢病毒载体构建成功；
　　6．荧光显微镜观察显示过表达 DUSP1慢病毒载体成功感染人成纤维样滑膜细胞；
　　7．CCK-8结果显示过表达DUSP1能够抑制人骨关节炎成纤维样滑膜细胞增殖活性；
　　8．Western blot结果表明过表达DUSP1能够抑制p38MAPK、JNK信号通路活性及MMP-13、COX-2的表达。
　　结论:
　　1．人正常及骨关节炎成纤维样滑膜细胞中 DUSP1表达存在差异，在骨关节炎成纤维样滑膜细胞中DUSP1表达明显受到抑制；
　　2．地塞米松能够诱导人骨关节炎成纤维样滑膜细胞中 DUSP1表达，并抑制p38MAPK、JNK信号通路的活化及骨关节炎相关效应分子如MMP-13、COX-2等的表达，初步说明地塞米松至少是部分通路诱导DUSP1的表达发挥其抗炎及抗分解代谢的作用。
　　3．初步证实了DUSP1能够通过抑制p38MAPK及JNK信号通路的激活发挥抗炎及抗分解代谢作用，对骨关节炎起到保护作用。
　　4．过表达 DUSP1能够明显抑制人骨关节炎成纤维样滑膜细胞的增殖活性，初步说明了DUSP1对人骨关节炎滑膜增生可能具有一定的抑制作用。

目录

声明

缩略语表

前言

文 献 回 顾

1 炎症在骨关节炎发病中的作用机制

2 骨关节炎相关信号通路

3 双特异性磷酸酶1（DUSP1）研究进展

实验一 人正常及骨关节炎成纤维样滑膜细胞的体外培养及鉴定

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

实验二 人正常及骨关节炎成纤维样滑膜细胞中DUSP1的表达及意义

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

实验三 地塞米松抑制MAPK信号通路激活及相关效应分子的表达

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

实验四 DUSP1过表达慢病毒载体的构建及对OA成纤维样滑膜细胞的感染

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

实验五 过表达DUSP1对骨关节炎成纤维样滑膜细胞的影响

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

小结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢