高氧富氢液对大鼠失血性休克后复苏期肝损害的保护作用

摘要

失血性休克是临床最常见的疾病之一，常因大量失血引起。当血容量不足，失代偿时就会出现休克综合征。机体进而通过神经-体液内分泌调节机制引起周围血管收缩、血管阻力增加、心率（Heart rate，HR）加快等，最终造成组织器官病变及功能不全，严重时可继发多器官功能障碍综合征（Multiple organ dysfunction syndrome， MODS）。失血性休克治疗的关键是及时补充血容量以及阻断继续失血失液。但是液体复苏再灌注时机体会产生大量细胞毒性物质如过氧化氢（H2O2）、羟自由基（·OH）等，加重由失血性休克引起的细胞损伤。因此，当血液制品不可用或者出血控制延迟时，用于复苏的液体种类起着至关重要的作用。常用的液体有等渗晶体、胶体、高渗溶液、人工氧载体和血液代用品，目前尚没有一种在失血性休克时既能辅助供氧和补液，又能改善再灌注所致的自由基损伤的液体。
　　失血性休克后复苏期常发生肺、胃肠道、肝、肾、脑、心等内脏器官损害。其中失血性休克后复苏期肝损伤是临床常见危重急症，常继发于肺、胃肠道损伤后。如若发生了严重的肝损伤，因缺乏直接有效的防治措施，患者死亡率几乎可达100％。失血性休克后复苏期肝损伤的发病机制非常复杂，其根本原因是失血性休克引起的肝能量代谢障碍、清除功能障碍和顽固性低氧血症以及再灌注损伤引起的难以控制和改善的失控性炎症反应、氧化应激反应等。因此，如何有效控制全身失控性炎症反应的发生、发展及转归，切实有效的改善缺氧，对降低失血性休克后复苏期肝损害的病死率具有极其重要的临床意义。
　　自2007年以来，越来越多的研究发现分子氢能够选择性的清除强活性自由基、及时调控自由基、减轻早期炎症反应、抑制氧化应激以及对抗细胞凋亡。此外，近年来，大量研究发现高氧液(Hyperoxygenated solution，HOS)可以通过非呼吸道辅助供氧，临床大样本分析证实HOS是目前缓解严重失血性休克后肺弥散功能障碍性缺氧的最有效途径之一。
　　本研究中，我们率先制备溶解氢含量≥0.50mmol/L、氧含量≥20mg/L的高氧富氢液（Hyperoxygenated hydrogen rich solution，HHOS），参考改良Wigger法，构建大鼠重度失血性休克模型：由股动脉放血，使平均动脉压（Mean arterial pressure，MAP）降至30～40mmHg，通过放血或自体血回输维持MAP在30～40mmHg，持续60min，随后进行复苏。于股静脉分别注射乳酸林格液（Ringer’s solution，LRS）、HOS、富氢液（Hydrogen-rich solution，HHS）以及HHOS，分别于开始复苏后2h、6h取血液和肝组织标本，检测肝功能、炎性因子、氧化应激、凋亡等指标，探究HHOS对大鼠失血性休克后复苏期肝损害的作用及可能机制。结果显示：与LRS复苏相比，HOS、HHS及HHOS复苏后均能显著降低大鼠血清谷丙转氨酶(Serum alanine,ALT)、谷草转氨酶(Aspartate aminotransferase，AST)、肝组织白介素-6(Interleukin-6，IL-6)、肿瘤坏死因-α(Tumor necrosis factor-alpha，TNF-α)和丙二醛（Malondialdehyde，MDA）的水平；增加肝组织 IL-10阳性细胞数目；升高肝组织总过氧化物歧化酶（Total-superoxide dismutase，T-SOD）的含量； H&E染色结果显示：大鼠肝细胞肿胀、脂肪变性、空泡样变性显著减少；肝小叶中央静脉和肝血窦淤血明显减轻；中央静脉及汇管区周围炎症细胞浸润减少；caspase-3及 TUNEL阳性细胞数目减少。其中，HHOS的上述保护作用强于HOS及HHS。上述研究结果提示，HHOS为机体提供有效氧供的同时还减轻了失血性休克后复苏期所致的自由基损伤，为治疗失血性休克后复苏期肝损害提供了新的治疗思路。
　　综上所述，本研究首次证实HHOS能够恢复失血性休克肝组织的氧供和灌注，清除再灌注后产生的强活性自由基及炎性介质等，能够发挥分子氢和分子氧的协同或相加的药理作用，成为失血性休克后复苏的理想液体，并为HHOS的转化研究提供理论基础和实验依据。
　　第一部分高氧富氢液对大鼠失血性休克后复苏期肝功能影响的研究
　　目的：
　　1．明确HHOS对大鼠失血性休克后复苏期肝功能的作用。
　　2．探索 HHOS对大鼠失血性休克后复苏期肝组织病理学及超微结构改变的影响。
　　方法：
　　1．SPF级健康SD大鼠，6～8周龄，体重280～320 g。采用随机数法分为5组，每组6只，SHAM组给予假手术处理，乳酸林格液组（LRS组）、高氧液组（HOS组）、富氢液组（HHS组）和HHOS组（HHOS组）在大鼠休克1h后，分别用LRS、HOS、HHS和HHOS进行复苏，在复苏2h及6h时取材。
　　2．采用自动化分析仪检测各组大鼠血清ALT和AST的浓度。
　　3．组织切片后，通过 H&E染色观察组织病理学改变，在电镜下观察各组大鼠肝组织超微结构变化。
　　结果：
　　1．大鼠失血性休克复苏后2h及6h血清ALT和AST结果显示：与SHAM组比较，LRS组、HOS组和HHS组在复苏后2h，6h血清ALT和AST水平升高(P＜0.05)， HHOS组在复苏后6h血清ALT和AST水平升高(P＜0.05)。与LRS组和HOS组比较， HHOS组在复苏后2h，6h血清ALT和AST水平明显降低(P＜0.05)；与HHS组比较， HHOS组在复苏后2h血清ALT水平明显降低(P＜0.05)，复苏后6h血清AST水平明显降低(P＜0.05)。
　　2．大鼠失血性休克复苏后2h及6h肝组织H&E染色结果显示：与SHAM组比较，其余4组大鼠肝组织有不同程度的病理学改变，具体表现在：肝小叶排列紊乱；肝细胞出现空泡样改变、脂肪变性及点状坏死；中央静脉及汇管区周围出现大量炎症细胞浸润。而HHOS组这些组织病理学改变显著轻于LRS组、HOS组和HHS组，尤其是空泡样改变显著减少。
　　3．大鼠失血性休克复苏后2h及6h肝组织透射电镜结果显示：与SHAM组比较，其余4组大鼠肝组织有不同程度的超微结构的损伤，具体表现在：肝细胞内出现空泡样变；此外可见大量自噬小体；核固缩变小或异染色质聚集；线粒体高度肿胀、变形、嵴减少、排列紊乱、甚至崩解、空泡形成等；内质网(Endoplasmic reticulum， ER)明显扩张，呈空泡样结构；毛细胆管内微绒毛减少等。而HHOS组这些超微结构改变显著轻于LRS组、HOS组和HHS组，尤其是空泡样改变显著减少。
　　结论：
　　本部分实验通过构建大鼠失血性休克复苏模型，证实了HHOS能够减轻大鼠失血性休克后复苏期肝损害，提高大鼠失血性休克后复苏期肝功能，并且减轻组织病理学及超微结构损伤，为HHOS作为失血性休克后复苏的理想液体提供实验依据和理论基础，也进一步明确了HHOS在失血性休克再灌注中的作用机制。
　　第二部分高氧富氢液对大鼠失血性休克后复苏期肝脏炎症反应的研究
　　目的：
　　1．探索HHOS对大鼠失血性休克后复苏期肝组织内促炎因子的作用。
　　2．探究HHOS对大鼠失血性休克后复苏期肝组织内抑炎因子的作用。
　　方法：
　　1．动物选择及分组，HOS、HHS及 HHOS制备及保存及复苏方法，实验标本的采集及相关指标的检测方法同第一部分实验。
　　2．按照大鼠IL-6 ELISA试剂盒及大鼠TNF-αELISA试剂盒说明书检测各组大鼠肝组织IL-6及TNF-α的改变。
　　3．免疫组织化学染色法检测各组大鼠肝组织IL-10的表达情况。
　　结果：
　　1．大鼠失血性休克后复苏2h及6h肝组织IL-6和TNF-α的结果显示，与SHAM组比较，LRS组和HOS组在复苏后2h肝组织IL-6、TNF-α水平增高(P＜0.05)，LRS组、HOS组和HHS组在复苏后6h肝组织IL-6、TNF-α水平增高(P＜0.05)。与LRS组和HOS组比较，HHOS组在复苏后2h肝组织IL-6、TNF-α水平降低(P＜0.05)。与LRS组、HOS组和HHS组比较，HHOS组在复苏后6h肝组织IL-6、TNF-α水平降低(P＜0.05)。
　　2．免疫组织化学染色结果显示，与SHAM组比较，LRS组、HOS组和HHS组在复苏后2h，6h肝组织IL-10阳性细胞数目减少。与LRS组、HOS组和HHS组比较，HHOS组在复苏后2h，6h肝组织IL-10阳性细胞数目明显增加。
　　结论：
　　本部分实验通过ELISA法检测各组大鼠肝组织IL-6及TNF-α的改变，免疫组织化学染色法检测各组大鼠肝组织 IL-10的表达水平，明确了HHOS可以降低大鼠失血性休克后复苏期肝组织内促炎因子的水平，增加抑炎因子的水平，提示 HHOS对大鼠失血性休克后复苏期肝损害的保护作用可能与HHOS抑制炎症反应有关。进一步揭示了HHOS在失血性休克后复苏期发挥保肝作用的新机制，也为HHOS的临床转化应用奠定理论依据和实验依据。
　　第三部分高氧富氢液对大鼠失血性休克后复苏期肝脏氧化应激反应的研究
　　目的：
　　1．探明HHOS对大鼠失血性休克后复苏期肝脏氧化应激反应的作用。方法：
　　1．动物选择及分组，HOS、HHS及 HHOS制备及保存及复苏方法，实验标本的采集及相关指标的检测方法同第一部分实验。
　　2．按照大鼠总超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD)试剂盒，MDA试剂盒说明书检测各组大鼠肝组织T-SOD及MDA的改变。
　　结果：
　　大鼠失血性休克复苏后2h及6h肝组织MDA及T-SOD结果显示：与SHAM组比较，LRS组、HOS组和HHS组在复苏后2h，6h肝组织MDA水平升高(P＜0.05)，肝组织T-SOD水平降低(P＜0.05)；HHOS组在复苏后2h，6h肝组织T-SOD水平降低(P＜0.05)。与LRS组、HOS和HHS组比较，HHOS组在复苏后2h，6h肝组织MDA水平降低(P＜0.05)，肝组织T-SOD水平增高(P＜0.05)。
　　结论：
　　本部分实验通过检测各组大鼠肝组织T-SOD及MDA的改变，明确了HHOS能够抑制大鼠失血性休克后复苏期肝组织的氧化应激反应，从而发挥肝保护作用。该部分结果提示HHOS对大鼠失血性休克后复苏期肝损害的保护作用可能与HHOS减轻大鼠失血性休克后复苏期肝细胞凋亡数量,提示HHOS可通过减轻凋亡反应发挥对大鼠失血性休克后复苏期肝保护作用,为下一步研究HHOS的肝保护机制奠定基础,也为HHOS的临床应用提供了新的理论基础和实验依据。

目录

声明

缩略语表

前言

文献回顾

1 失血性休克后复苏期肝损害的发病机制及研究进展

2 失血性休克后复苏期肝损害的防治进展

第一部分 高氧富氢液对大鼠失血性休克后复苏期肝功能影响的研究

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

5 小结

第二部分 高氧富氢液对大鼠失血性休克后复苏期肝脏炎症反应的研究

1 材料

2 方法

3 结果

4讨论

5 小结

第三部分 高氧富氢液对大鼠失血性休克后复苏期肝脏氧化应激反应的研究

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

5 小结

第四部分 高氧富氢液对大鼠失血性休克后复苏期肝细胞凋亡反应影响的研究

1 材料

2方法

3 结果

4 讨论

5 小结

小结

参考文献

附录

个人简历和研究成果

致谢