基于聚乙烯亚胺的两类基因递送载体的构建及其体内外转染特性研究

摘要

研究背景：
　　基因治疗是一种通过载体将核酸、反义寡核苷酸或者小干扰RNA等基因药物递送到靶细胞内，通过调控特定基因表达，达到治疗疾病目的的生物医学治疗方法。基因治疗不仅可以用于遗传性疾病的治疗，而且可为预防和治疗癌症、病毒感染、糖尿病以及艾滋病等提供良好的方法，已成为生物医学治疗的重要组成部分。基因治疗的成功实现离不开优良的基因递送载体，基因递送载体主要分为病毒和非病毒载体。病毒载体的基因转染效率较高，但是由于其负载基因片段大小有限制，具有免疫原性，难以实现工业化生产，有可能产生插入突变以及可能引起严重的安全问题等，使其临床应用受到限制。非病毒载体生产成本相对较低，具有低的免疫原性和细胞毒性，可递送较大片段的基因等许多优点，已经成为基因递送载体研究的热点。
　　聚乙烯亚胺（Polyethyleneimine，PEI）是一种被广泛研究的基因递送非病毒载体，在不同细胞和转染条件下展现出稳定高效的基因转染效果，其中PEI25k更被视作基因转染的“黄金标准”。高密度的伯胺、仲胺和叔胺基团使得 PEI在较广的 pH范围内具有显著的缓冲能力，该特性被称作“质子海绵效应”，也是PEI高转染活性的关键因素之一。虽然 PEI在基因递送领域具有极为广阔的应用前景，但仍存在体内转染效率低，细胞毒性大和溶酶体降解等亟需解决的问题。因此，以 PEI为基础设计构建高效低毒的基因递送载体具有重要的理论意义和实用价值。
　　研究目的：
　　综合考虑基因治疗和 PEI递送载体的研究现状，分别以线性和支化聚乙烯亚胺为起始原料，设计并合成两类新型递送载体并用于基因转染研究。第一类是以线性聚乙烯亚胺LPEI25k和α-环糊精为原料，制备得到超分子准聚轮烷，并以2,4-二硝基苯甲醛作为封端基团，合成得到酸敏封端和非酸敏封端的两种新型聚轮烷，以期获得高转染效率和低毒性的基因递送载体。第二类是以支化聚乙烯亚胺 BPEI25k为原料，制备得到甘露醇修饰的阳离子聚合物，通过甘露醇的引入增强小窝蛋白介导的内吞途径对基因载体的胞内转运，从而一定程度避免溶酶体的降解，以期获得高效低毒的基因递送载体。
　　实验方法：
　　1、以 LPEI25k和α-环糊精为起始原料，通过主客体分子的包合作用得到准聚轮烷LPEI25k/CD，并以2,4-二硝基苯甲醛作为封端基团，通过醛胺缩合得到酸敏基团席夫碱封端的聚轮烷LPEI25k/CD-PA，继而使用氰基硼氢化钠对席夫碱进行还原，得到非酸敏基团封端的聚轮烷LPEI25k/CD-PB。以BPEI25k为起始原料，通过还原胺化反应制备得到4种不同取代度甘露醇修饰的阳离子聚合物基因载体。通过核磁共振氢谱、红外光谱和元素分析对合成中间体和载体材料结构进行鉴定。
　　2、通过凝胶阻滞实验测定上述两类载体材料对pDNA的复合能力；采用纳米粒度和Zeta电位分析仪对载体材料/pDNA复合物的粒径、PDI和Zeta电位进行表征；利用流式细胞仪以及荧光显微镜，以表达增强绿色荧光蛋白的pEGFP为递送基因，以基因转染的“黄金标准”PEI25k作为阳性对照，在HEK293T细胞评价所合成的7种基因递送载体材料的体外转染活性，并且在血清存在下对优选的基因递送载体材料的转染活性进行了评价；使用MTT实验对优选的2种基因递送载体材料的毒性进行测定。
　　3、通过3种特异性的内吞途径抑制剂对优选载体材料 LPEI25k/CD和BPEI25k-man-L的入胞机制进行研究。以14位酪氨酸磷酸化小窝蛋白-1表达作为检测指标，采用Western-blot实验，对甘露醇修饰的BPEI25k-man-L的内吞介导机制进行研究。
　　4、以裸鼠为实验对象，采用尾静脉注射的方法，以 pEGFP基因为报告基因，观察GFP在动物体内的表达及分布情况，对优选的载体材料进行体内转染活性评价。结果与讨论：
　　1、LPEI25k准聚轮烷和聚轮烷基因递送载体的构建与评价
　　（1）经核磁共振氢谱和红外光谱鉴定，所合成的准聚轮烷LPEI25k/CD及聚轮烷LPEI25k/CD-PA和LPEI25k/CD-PB均为目标产物。
　　（2）LPEI25k/CD，LPEI25k/CD-PA和LPEI25k/CD-PB/pDNA复合物的平均粒径分别是384.9、175.4和162.6 nm，粒径分布的多分散性指数分别是0.333、0.150和0.198，复合物的Zeta电位分别3.57、4.03和5.54 mV，三种材料都可以和pDNA形成规则球形并且荷正电的纳米粒，可以用于基因的递送研究。凝胶阻滞实验表明，3种载体都可以在重量比1:1时完全复合pDNA，其中准聚轮烷LPEI25k/CD可以在更低的重量比1:2下与pDNA复合完全，具有和阳性对照LPEI25k相当的复合能力，同时展现出比聚轮烷LPEI25k/CD-PA和LPEI25k/CD-PB更好的复合能力。
　　（3）体外基因转染活性研究结果表明，与LPEI25k相比，准聚轮烷LPEI25k/CD展现出与之相当甚至较高的转染活性，聚轮烷LPEI25k/CD-PA和LPEI25k/CD-PB虽然展现出较低或相当的平均荧光强度，但是阳性转染细胞数较低。与酸敏键封端的LPEI25k/CD-PA相比，非酸敏键封端的LPEI25k/CD-PB在三种N/P下均表现出较低的阳性转染细胞数和平均荧光强度，表明酸敏键封端的聚轮烷比非酸敏键封端的聚轮烷表现出更好的转染效率。在10％血清存在下，LPEI25k在N/P重量比10:1，20:1和50:1的情况下转染效率均明显的降低；但是对于LPEI25k/CD而言，在重量比为10:1时，阳性转染细胞数和平均荧光强度均与不加血清条件下的转染效果相当。而且，当N/P重量比增至20:1和50:1时，相对于LPEI25k，LPEI25k/CD的转染受血清的影响较小，表现出稳定的转染效率和体内应用前景。
　　（4）MTT实验结果表明，LPEI25k/CD（IC50=30.7μg/mL）比LPEI25k（IC50=20.0μg/mL）表现出更低的毒性，具有更好的生物相容性和安全性。
　　（5）酶降解保护实验表明，LPEI25k/CD和LPEI25k都具有良好的pDNA保护能力。进一步的基因释放能力实验表明，与 LPEI25k相比，LPEI25k/CD复合物中pDNA的解离释放更为容易。
　　（6）内吞途径抑制实验结果显示，LPEI25k/CD/pDNA复合物的主要入胞机制为网格蛋白介导的内吞途径。
　　（7）体内转染实验结果表明，LPEI25k/CD/pDNA复合物单次给药后可以在裸鼠体内有效和持续地表达GFP，能够高效递送的主要器官依次为睾丸、脑、肝、肺、肾、脾脏和心脏。
　　2、BPEI25k阳离子聚合物基因递送载体的构建与评价
　　（1）经核磁共振氢谱和红外光谱鉴定，所合成的4种 BPEI25k阳离子聚合物BPEI25k-man-S/L/M/H均为目标产物。经元素分析测定，BPEI25k-man-S/L/M/H中甘露醇的接枝度分别为20.8、47.0、56.2和171.1个。
　　（2）BPEI25k-man-S/L/M3种阳离子聚合物在四种N/P重量比下与pDNA形成的纳米复合物的粒径，PDI和Zeta电位与BPEI25k相当，BPEI25k-man-H的电位和BPEI25k相当，但是其粒径较大。凝胶阻滞实验结果显示，除了BPEI25k-man-H在N/P为1:1时与pDNA完全复合，BPEI25k-man-S/L/M3种阳离子聚合物均可以在低氮磷比N/P为1:2时与pDNA完全复合。4种阳离子聚合物均符合基因载体的基本要求，可以进行进一步的研究。
　　（3）体外转染结果表明，在低氮磷比N/P为1:2时，4种载体材料的转染效率均低于BPEI25k（N/P为2:1）；在N/P为2:1、5:1和10:1时，BPEI25k-man-L具有和对照相当的阳性转染细胞数和平均荧光强度，BPEI25k-man-S和 BPEI25k-man-M的阳性细胞数低于对照，但是平均荧光强度与之相当，BPEI25k-man-H的阳性细胞数和平均荧光强度均低于对照。其中具有适度甘露醇接枝度的BPEI25k-man-L在N/P为2:1、5:1和10:1时均表现出和阳性对照相当的转染效率，可作为候选基因载体进行进一步的研究。10%血清存在下的转染结果显示，对照BPEI25k在N/P重量比2:1时的阳性转染细胞数明显降低，但是 BPEI25k-man-L的转染活性与不加血清下的转染效果相当，表现出稳定的转染效率和极好的体内应用前景。
　　（4）MTT实验结果表明，BPEI25k-man-L（IC50=31.4μg/mL）比阳性对照BPEI25k（IC50=15.3μg/mL）展现出更低的毒性，表现出更好的生物相容性和安全性。
　　（5）酶降解保护实验结果显示，BPEI25k-man-L和阳性对照BPEI25k都具有良好的pDNA保护能力。
　　（6）内吞途径抑制实验结果显示，BPEI25k/pDNA复合物在 HEK293T细胞主要通过网格蛋白介导的内吞和小窝蛋白介导的内吞入胞，其中，网格蛋白介导的内吞途径占稍大的比例；甘露醇修饰的BPEI25k-man-L/pDNA复合物在HEK293T细胞上可通过3种内吞途径入胞，主要通过小窝蛋白介导的内吞入胞。上述研究结果表明，对BPEI25k进行甘露糖醇修饰可改变BPEI25k的内吞途径，增强小窝蛋白介导的内吞。进一步的 Western-blot实验结果显示，经由甘露醇修饰后的基因载体BPEI25k-man-L可激活Src酪氨酸激酶诱导的小窝蛋白-1的磷酸化，刺激小窝的形成和从质膜脱落入胞，从而增强小窝蛋白途径介导的基因载体入胞。
　　（7）体内转染实验结果表明，BPEI25k-man-L/pDNA复合物单次给药即可展示很好的体内转染效果，可以在体内持续地表达 GFP，能够高效递送的主要器官依次为脑、睾丸、肝、肾、肺、心脏和脾脏。
　　结论：
　　本文设计合成了两类7种基于PEI的准聚轮烷和聚轮烷及阳离子聚合物基因载体，并对其进行了结构表征、体内外基因转染活性和入胞机制的研究。实验研究结果显示，所得7种基因载体材料均为目标产物。两类载体材料中准聚轮烷LPEI25k/CD和甘露醇修饰的 BPEI25k-man-L转染效果最好，表现出高效低毒的特性。入胞途径研究结果显示，LPEI25k/CD/pDNA复合物主要通过网格蛋白介导的内吞途径入胞；甘露醇修饰的 BPEI25k-man-L主要通过小窝蛋白介导的内吞途径入胞，其内吞途径的改变主要与甘露醇的引入激活小窝蛋白-1的磷酸化，刺激小窝途径的细胞摄取有关。进一步的体内转染实验研究结果表明，LPEI25k/CD和BPEI25k-man-L单次给药后即可在体内展示高效持久的转染效果，具有作为基因载体进行进一步研究的潜力，可望为基因治疗提供安全有效的递送载体。

目录

声明

缩略语表

前言

文献回顾

1 聚乙烯亚胺的理化特性

2 基于LPEI的基因递送载体

3 基于BPEI的基因递送载体

3.1 基于低分子量BPEI的基因递送载体

第一部分 LPEI25k准聚轮烷和聚轮烷的制备及其转染特性研究

实验一 LPEI25k准聚轮烷和聚轮烷的制备和表征

1 材料

2 方法

3 结果与讨论

实验二 LPEI25k准聚轮烷和聚轮烷的转染特性研究

1 材料

2 方法

3 结果与讨论

小结

第二部分BPEI25k阳离子聚合物的制备及其转染特性研究

实验一 BPEI25k阳离子聚合物的制备和表征

1 材料

2 方法

3 结果与讨论

实验二 BPEI25k阳离子聚合物的转染特性研究

1 材料

2 方法

3 结果与讨论

小结

全文结论

参考文献

附录

个人简历和研究成果

致谢