中国部分地区2010-2013年基因VII型新城疫病毒F、HN基因分子特征分析及病毒样颗粒的构建

摘要

新城疫（New Disease，ND），俗称亚洲鸡瘟，是由新城疫病毒强毒株引起的一种急性、高度接触性传染病。世界动物卫生组织（OIE）将新城疫列为法定报告疫病。我国在《国家中长期动物疫病防治规划（2012-2020年）》中把新城疫列为16种国内优先防治的动物疫病之一。新城疫病毒属于副粘病毒科（Paramyxoviridae），禽腮腺炎病毒属（Avulavirus）。对于新城疫的防控我国主要依赖疫苗免疫防控新城疫。目前，我国禽群中普遍使用的弱毒疫苗主要为基因II亚型的La Sota疫苗株，而我国的优势流行株为VII型。在遗传进化学上疫苗株与流行株之间相差较远，且抗原差异性也较大，被认为是该病在中国持续暴发和免疫失败的主要原因。虽然La Sota弱毒疫苗能对鸡群提供良好的临床保护效果，但在鸡群中仍会出现大量的排毒现象。为更好的应对ND流行，新城疫新型疫苗的研制对新城疫具有更好的防控意义。本文主要从以下三个方面进行相关研究：
　　试验一：中国部分地区2010-2013年基因VII型NDV F和HN基因分子特征分析
　　本实验整理了NCBI收录的2012年以前中国分离到的所有NDV F全基因序列，共计452株。通过核苷酸比对分析，证实近年来我国主要的流行毒株为ClassII的基因VII型。对2010-2012年分离的代表株45株和2013年春季流调代表株14株，共计59株NDV进行了分子遗传进化分析，结果证实基因VIIb亚型52株、基因VIId型3株、基因VIIh4株。随后对59株NDV的F和HN基因重要功能区域的核苷酸序列进行分析，结果发现，部分毒株F基因裂解位点和HN基因的重要抗原位点发生了明显的变异。
　　试验二：新城疫 VII型疫苗候选株的筛选
　　在NDV F、HN基因分子特征分析的基础上，挑选8株VII型NDV。经致病指数（MDT、ICPI、IVPI）以及F裂解位点序列分析，证实8株NDV均为强毒株；攻毒保护试验结果显示，La Sota灭活疫苗能对分离株的攻击提供临床保护，但在攻毒后的第1、3、5天仍可出现排毒现象。最终根据毒力、鸡胚繁殖性能及排毒情况筛选出一株基因VII型疫苗候选株。
　　试验三：基因VII型新城疫病毒样颗粒疫苗的构建
　　使用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统，以pFastBac Dual转移载体为骨架，将基因VII型疫苗候选株的全长F、HN、M、NP基因片段克隆到pFastBac Dual供体质粒上，构建出重组供体质粒。随后转化DH10Bac感受态细胞，获得重组杆状病毒基因组。经转染获得重组杆状病毒种毒后，同时感染Sf9昆虫细胞，经Western blot试验在培养上清中检测到了F、M和NP蛋白的表达。另外，血凝试验表明VLPs具有较高的凝集鸡血红细胞的能力，且间接免疫荧光试验也证实Sf9细胞中有蛋白表达，表明病毒样颗粒已初步构建成功，为研制基因VII型病毒样颗粒疫苗奠定了基础。

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前言

文献综述

1 NDV的生物学特性

2 NDV 的基因组与结构蛋白特征

3 NDV致病的分子基础

4 分子生物学诊断技术

5.杆状病毒表达系统简介

6．研究目的与意义

试验一 中国部分地区2010-2013年基因VII型NDV F、HN基因分子特征分析

1材料与方法

2结果

3 讨论

试验二 基因VII型新城疫病毒候选疫苗株的筛选

1材料与方法

2结果

3 讨论

试验三 基因VII型新城疫病毒样颗粒的构建

1材料与方法

2结果

3讨论

全文总结

参考文献

缩略词表

导师组意见

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