凋亡在低氧性肺动脉重构自然逆转中的作用及分子机制研究

摘要

低氧性肺动脉高压（hypoxic pulmonary hypertension，HPH）是以肺小动脉收缩及重构为主要特征的慢性渐进性疾病，多见于慢性呼吸系统疾病以及原发性高原病，是肺动脉高压（pulmonary hypertension, PH）的一种较常见类型。长期、持续的肺动脉高压，可诱发右心衰竭最终导致患者死亡。低氧性肺动脉重构作为HPH最显著的病理改变，是肺动脉压力持续升高的重要因素。尽管目前有多种药物可应用于肺动脉高压的治疗，但大都不能有效地抑制或逆转肺动脉重构的发生。近年来有大量研究表明，恢复常氧后，低氧性肺动脉重构尤其增厚的肺动脉中膜层，可逐步逆转。
　　关于肺动脉重构的逆转过程，即增厚的肺动脉壁的逐渐变薄，我们推测此细胞数目减少的过程一定与“死亡大于新生的细胞数”有关。只有在此种情况下，肺血管壁上增多的细胞，才能被有效的清除掉，而最终达到肺血管壁逆转的目标。所以，复氧期“细胞死亡”与“细胞增殖”间平衡的动态变化，将是影响肺动脉重构逆转的关键因素。目前，已知的细胞死亡方式，主要有凋亡（apoptosis）、自噬（autophagy）、坏死（necrosis）及程序性坏死（necroptosis）等。那么在低氧性肺动脉重构复氧逆转的过程中，究竟是“细胞死亡”还是“细胞增殖”的改变导致了肺动脉重构的逆转，目前尚不清楚。
　　对于有氧代谢的细胞，低氧、复氧作为较常见的应激性刺激，常可影响其正常的代谢过程进而导致细胞功能的紊乱、甚至死亡。例如，在心肌缺血再灌注（低氧-复氧）损伤中，常伴有氧化呼吸爆发及 ROS的大量产生。急剧增多的 ROS作为一种损伤性因子，可引起细胞内许多大分子物质及细胞器发生严重的损伤，例如线粒体的损伤，最终导致心肌细胞的凋亡。在低氧性肺动脉重构复氧逆转的过程中，是否也伴有严重的氧化应激性损伤，还需进一步研究。
　　【研究目的】
　　1、明确低氧性肺动脉重构在恢复常氧条件后的改变，及其发生的相关机制。
　　2、从氧化损伤的角度，更加深入地探讨低氧性肺动脉重构复氧逆转的分子机制。
　　【研究方法】
　　1、成年雄性SD大鼠随机分为：常氧4周组（normoxia for4 weeks, N）、低氧4周组（hypoxia for4 weeks, H）、低氧4周后复氧1周组（reoxygenation for1 week after hypoxia for4 weeks, R1）及低氧4周后复氧6周组（reoxygenation for6 weeks after hypoxia for4 weeks, R6）。常氧组大鼠，在常氧条件下（21％O2）饲养4周。低氧组大鼠，每天在低压低氧舱内（10% O2）暴露8小时，连续处理4周。复氧组大鼠，在低氧4周干预结束后继续转至常氧条件下分别饲养1周和6周。所有处理结束后，分别检测各组大鼠右室收缩压（right ventricle systolic pressure, RVSP）、右室肥厚指数（RV/（LV+Sep））、肺小动脉中膜厚度（medial thickness, MT）及面积(medial area, MA)等，观察其在低氧-复氧过程中的变化。
　　2、各组肺组织石蜡切片，分别进行 TUNEL染色以及免疫组化检测α-SMA、cleaved-caspase3、Bax、Bcl-2、LC3及 P62等在肺动脉中膜中的表达。再者，应用Western blotting法检测各组肺组织中cleaved-caspase3/PARP、Bcl-2、Bax、PCNA、LC3及P62的表达。另外，应用过氧化氢检测试剂盒，分别检测各组肺组织中H2O2的含量。
　　3、取3-5代对数生长期的PASMCs进行低氧（5% O2）干预0、24、36、48、60及72 h，MTT法确定低氧条件下细胞生长最活跃的时间点；然后在此低氧的基础上，将PASMCs转至常氧条件下继续培养0、24、36、48及60 h，观察细胞的生长率在复氧过程中的变化。
　　4、分别使用Annexin V-PI染色、BrdU检测以及Western blotting法，检测PASMCs的凋亡及增殖在复氧过程中的变化。再者，使用Western blotting技术检测PASMCs中LC3及P62的表达，明确其自噬水平在复氧阶段的变化。
　　5、体外培养的PASMCs分别使用DCFH-DA（2’,7’-Dichlorofluorescin diacetate）及MitoSOX Red荧光染料，检测胞内总的ROS及线粒体的ROS（mitochondrial ROS, mROS）在复氧期的变化。再者，在使用了胞内非特异性 ROS清除剂 NAC（N-acetylcysteine）和mROS特异性清除剂MitoTEMPO后，分别观察ROS、mROS的变化，以确定复氧期胞内ROS的主要来源。另外，直接提取各组PASMCs线粒体，在胞外进一步观察mROS在复氧过程中的变化。最后，在应用了ROS清除剂后，观察复氧期PASMCs凋亡的变化，以确定复氧期增多的ROS对PASMCs凋亡的作用。6、使用线粒体膜电位（?Ψ）依赖性阳离子染料JC-1，分别检测各组PASMCs中线粒体膜电位在复氧过程中的变化；再者，通过提取各组PASMCs线粒体并检测其ATP合成功能，以确定复氧期 ROS/mROS对线粒体功能的影响。最后，应用 Western blotting法分别检测复氧期PASMCs中Bax、Bcl-2的表达，以及Cytochrome C（Cyto C）在胞浆和线粒体内分布的变化等，以确定线粒体功能对复氧期PASMCs凋亡发生的影响。
　　【研究结果】
　　1、RVSP、RV/(LV+Sep)、MT%及MA%等与HPH功能及结构相关的指标，在HPH大鼠被转至常氧条件后，可逐步逆转。
　　2、与低氧组相比，复氧显著增加了中膜PASMCs凋亡，而降低了其自噬及增殖水平。此外，复氧使肺组织中H2O2的水平显著升高。
　　3、MTT结果显示，低氧显著促进了PASMCs的生长，尤其在低氧48小时；当低氧48小时后将PASMCs转至常氧条件下继续培养，可见PASMCs的生长率与常氧组相比显著减慢，特别是低氧48小时后复氧24小时。
　　4、复氧期PASMCs的凋亡及增殖水平均较常氧组显著升高，但凋亡增加的更为显著。复氧期PASMCs的自噬水平，与常氧组无显著差异。
　　5、复氧阶段，PASMCs内总的ROS及mROS均显著升高；应用了NAC和MitoTEMPO后，总的ROS和mROS几乎同等程度地降低。同时，分离得到的线粒体的检测结果显示，复氧期mROS显著升高。此外，清除了ROS及mROS后，可见复氧阶段PASMCs的凋亡被显著抑制。
　　6、复氧期，PASMCs线粒体膜电位显著降低、线粒体ATP合成功能明显受损，再者线粒体膜间空间的Cyto C大量释放至胞浆。清除了PASMCs中ROS及mROS后，线粒体的膜电位、通透性水平以及ATP合成能力，基本恢复至正常水平。
　　【研究结论】
　　1、低氧性肺动脉高压特征性病理改变低氧性肺动脉重构，在恢复常氧条件后，可以逐步得到缓解，且PASMCs特异性的凋亡参与了此过程。
　　2、复氧阶段PASMCs内大量产生的ROS，尤其线粒体来源的ROS，诱发的线粒体损伤，最终启动了PASMCs内源性凋亡程序。

目录

声明

缩略语表

前言

文献回顾

一、低氧性肺动脉高压

二、低氧性肺动脉高压的自然逆转

三、细胞凋亡

四、细胞自噬

第一部分 复氧阶段低氧性肺动脉重构自然逆转的时程规律及相关机制研究

一、复氧对低氧性肺动脉高压，尤其肺动脉重构的影响

二、肺组织中凋亡、增殖、自噬及H2O2在低氧-复氧过程中变化

三、讨论

第二部分 低氧-复氧对PASMCs生物学行为的影响

1 实验材料与仪器

2 实验方法

3 实验结果

4 讨论

第三部分 ROS在PASMCs低氧-复氧后凋亡发生中的作用及机制研究

一、复氧对PASMCs胞内ROS产生的影响

二、复氧期PASMCs增多的ROS对其线粒体功能的影响

三、讨论

小结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢