利用循环microRNA诊断骨质疏松的临床研究

摘要

背景:骨质疏松症（osteoporosis）是全球第四大危害人类健康的疾病，主要表现为渐进性的骨量丢失（bone loss）和骨骼脆性（skeleton fragility）增加。骨质疏松症的发生与发展通常没有明显的症状（symptom），一般是在体格检查或者并发症发生时才被发现。脆性骨折（fragility fracture）是骨质疏松症的最主要、也是最严重的并发症之一，有近一半的骨质疏松患者曾至少发生过一次脆性骨折。长骨和中心骨的骨折常导致患者行动不便、瘫痪甚至死亡，给家庭、社会带来巨大的经济与精神负担。因此，骨质疏松的早期诊断对于预防严重的骨量丢失和脆性骨折是至关重要的。目前，临床诊断骨质疏松症的金标准（gold standard）是基于双能X线扫描术（dual energy X-ray absorptiometry，DXA）的骨密度检测。然而，较高的价格、不可移动性以及潜在的辐射危险都限制了DXA在临床中的应用。所以，探索一种灵敏性高、特异性强、方便性佳的骨质疏松诊断技术对于骨质疏松的防治是必要的。
　　循环microRNA（circulating microRNA）是一种存在于体液中的微小RNA，在体内能够特异性表达，在体外能够长时间稳定存在。与传统血清学标志物相比，循环microRNA具有灵敏性高、特异性强、稳定性好等多种优势。研究表明，循环microRNA表达的异常与疾病的病理生理进程具有高度的相关性，因此具有作为分子诊断标志物的巨大潜力。目前，循环microRNA作为分子标志物，已在肿瘤及全身多系统疾病中表现出了较好的诊断效能（diagnostic performance）。虽然有研究发现循环microRNA在骨质疏松和其它骨骼疾病中的表达谱异常，但是，循环microRNA在骨质疏松症中的诊断作用及效能的评价有待研究。
　　目的:本研究试图通过高通量microRNA芯片研究、大样本量训练研究、独立验证研究以及动物模型研究等序列研究，探索骨质疏松发生过程中循环microRNA表达谱的变化，明确循环microRNA在骨质疏松诊断中的作用及诊断效能，为骨质疏松的分子生物学诊断提供实验依据。
　　方法:
　　1.样本代表性的评价。利用构成比分析法、箱状图分析法及相关性分析法等统计学方法对生物样本库中样本的基本信息、骨密度、T值等临床资料进行分析，与全国骨质疏松流行病学调查结果进行比对，明确样本的代表性。
　　2.差异性表达的循环microRNA的初步筛选。将各组样本等比例混样，利用高通量microRNA芯片检测技术筛选骨量正常、骨量降低、骨质疏松三者间差异性表达的循环microRNA。并通过表达量、变化趋势以及保守性等标准进一步筛选microRNA。
　　3.循环microRNA在诊断骨质疏松中作用及效能的评价。利用实时定量RT-PCR技术对骨量正常、骨量降低、骨质疏松样本（共288例）的循环microRNA表达量进行检测。通过箱状图分析法、受试者工作特征曲线分析法明确循环microRNA在三组样本中的变化趋势，以及对骨质疏松的诊断效能。
　　4.联合诊断模型的建立及评价。通过Logistic regression模型筛选对联合诊断模型有显著贡献的microRNA，并建立基于Logistic regression方程和简单线性方程的联合诊断模型。通过箱状图分析法、受试者工作特征曲线分析法明确循环microRNA在三组样本中的变化趋势，以及对骨质疏松的诊断效能。通过与传统骨转换标志物的比较，明确基于循环microRNA的联合诊断模型的优势。
　　5.循环microRNA及联合诊断模型在诊断骨质疏松中作用及效能的独立验证。利用实时定量RT-PCR技术对骨量正常、骨量降低、骨质疏松样本（共160例）的循环microRNA表达量进行检测。通过箱状图分析法、受试者工作特征曲线（receiver operating characteristic curve，ROC curve）分析法验证循环microRNA及联合诊断模型在三组样本中的变化趋势，以及对骨质疏松的诊断效能。通过与传统骨转换标志物的比较，验证基于循环microRNA的联合诊断模型的优势。
　　6.循环microRNA在骨质疏松预警及疗效监测中的作用及评价。通过建立衰老模型、卵巢切除模型及细胞治疗模型模拟人类骨质疏松和抗骨质疏松治疗。利用microCT扫描技术对不同年龄小鼠、卵巢切除后不同时间的大鼠、细胞治疗后大鼠的骨密度进行检测。利用实时定量RT-PCR技术对动物模型的循环microRNA表达量进行检测。通过箱状图分析法、受试者工作特征曲线分析法明确循环microRNA的变化趋势及诊断效能，明确循环microRNA在骨质疏松预警、疗效检测方面的作用。
　　结果:
　　1.生物样本库中共纳入了678例样本，骨质疏松样本在总样本中、男性样本中、女性样本中所占比例与全国骨质疏松流行病学调查的结果相近；骨密度与年龄、身高、体重、BMI等具有一定的相关性，与全国骨质疏松流行病学调查结果一致。
　　2.通过高通量microRNA芯片及纳入标准，筛选出22个在骨量正常、骨量降低、骨质疏松中渐变性、差异性表达的循环microRNA，其中13个呈现上调趋势，9个呈现下调趋势。
　　3.通过大样本量训练研究，进一步筛选出10个在骨量正常、骨量降低、骨质疏松中渐变性、差异性表达的microRNA。这10个microRNA能够单独诊断骨质疏松，但曲线下面积（AUC）、灵敏性、特异性及准确性均不理想。
　　4.成功建立了联合诊断模型。与单个循环microRNA相比，联合诊断模型诊断骨质疏松的曲线下面积（AUC）、灵敏性、特异性及准确性均大幅提升。基于Logistic regression方程建立的Index1的诊断效能高于基于简单线性方程建立的Index2。与血清tPINP和β-CTx相比，Index1的诊断效能明显升高；三者联合诊断模型Index1+P+C的诊断效能并不优于Index1。
　　5.通过独立验证研究，确认了单个循环microRNA能够单独诊断骨质疏松，但曲线下面积（AUC）、灵敏性、特异性及准确性均不理想。联合诊断模型诊断骨质疏松的曲线下面积（AUC）、灵敏性、特异性及准确性较单个循环microRNA确有显著提升。Index1的诊断效能高于Index2及血清tPINP、β-CTx，并且Index1+P+C的诊断效能并不优于Index1。
　　6.通过动物模型，明确了2月龄、8月龄、12月龄、16月龄小鼠的骨密度逐渐降低，血清miR-199a-5p的表达量逐渐降低。明确了假手术、卵巢切除后1天、卵巢切除后2周、卵巢切除后8周的大鼠骨密度逐渐降低，血清miR-199a-5p的表达量逐渐降低。明确了BMMSCs系统注射后，卵巢切除大鼠的骨量丢失明显减少，成骨平衡活性增强、破骨活性减弱，血清miR-199a-5p的表达量回升。
　　结论:
　　1.我们建立的生物样本库所纳入的样本能够反映骨质疏松流行病学基本特征，具有较好的临床代表性。
　　2.骨量正常、骨量降低和骨质疏松三类人群的血清microRNA表达谱存在差异，基于循环microRNA的分子生物学诊断方法可以有效诊断骨质疏松，并且具有替代传统骨转换标志物的潜质。
　　3.传统骨转换标志物的纳入不能有效提升联合诊断模型对骨质疏松的诊断效能。
　　4.循环microRNA具有预警骨质疏松和监测骨质疏松疗效的潜力。

目录

声明

缩略语表

前言

文献回顾

1 骨质疏松症及其临床诊断

2 循环microRNA

3 研究展望

第一部分 基于生物样本库的骨质疏松症相关的流行病学研究

1 实验材料

2 实验方法

3 实验结果

4 讨论

第二部分 高通量筛选骨质疏松发生过程中差异性表达的循环microRNA的研究（Discovery cohort）

1 实验材料

2. 实验方法

3. 结果

4 讨论

第三部分 基于循环microRNA的骨质疏松诊断模型的训练研究（Training cohort）

1 实验材料

2 实验方法

3 结果

4 讨论

第四部分 基于循环microRNA的骨质疏松诊断模型的独立验证研究（Validation cohort）

1 实验材料

2 实验方法

3 结果

4 讨论

第五部分 循环microRNA预警骨质疏松及监测骨质疏松疗效的探索性研究

1 实验材料

2 实验方法

3 结果

4 讨论

小结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢