高压氧对急性一氧化碳中毒大鼠脑内Keap1-Nrf2-ARE通路影响的研究

摘要

研究背景：
　　急性一氧化碳中毒（acute carbon monoxide poisoning，ACOP）是重大的公共卫生事件，是全世界死亡率最高的中毒。随着科技的发展和生活水平的提高，虽然我们可以预测哪些环境因素容易诱发急性一氧化碳中毒，从而尽可能的避免接触这些环境因素。但是某些环境因素是我们无法避免接触的，甚至我们有可能每天都在接触它们，如交通拥挤的地方、工业燃烧源附近、室内燃烧源附近等。急性一氧化碳中毒对全身器官有着广泛的影响，以脑损伤最为严重，主要表现为认知功能的下降，如注意力和记忆力的下降。而且即使经过治疗之后，仍有3％~30%的患者会发生迟发性脑病。急性一氧化碳中毒导致迟发性脑病的发病机制仍未被阐明，因而目前对迟发性脑病缺乏有效的治疗措施。因此急性一氧化碳中毒的危害需要我们重视。
　　一直以来，高压氧治疗（hyperbaric oxygenation therapy，HBOT）是急性一氧化碳中毒的治疗手段之一。有研究显示，HBOT可明显降低急性一氧化碳中毒患者6周及12个月以后的认知后遗症。但是，部分研究者发现HBOT可加重机体的氧化应激。然而近年来，也有研究者发现：HBOT可减轻组织缺血再灌注损伤所导致的氧化应激。但在HBOT是否会增加组织氧化应激损伤方面，目前还存在着争议。因此本研究拟探讨高压氧对急性一氧化碳中毒大鼠行为学以及脑组织抗氧化能力的影响。
　　Keap1-Nrf2-ARE通路是细胞内重要的抗氧化应激通路。该通路参与机体中一系列抗氧化基因的表达。有研究发现，低剂量的一氧化碳（carbon monoxide，CO）对缺血性卒中有重要的治疗作用，这种治疗作用可能与CO上调Nrf2的表达有关。也有研究发现高压氧可降低外伤性脑损伤的细胞凋亡，改善其认知功能，可能与上调Nrf2有关。然而高压氧对急性一氧化碳中毒大鼠脑内Keap1-Nrf2-ARE通路的影响仍然不清楚。因此我们观察了急性一氧化碳中毒大鼠脑组织Keap1和Nrf2的表达情况，以及经过HBOT之后急性一氧化碳中毒大鼠脑组织Keap1和Nrf2的表达变化，并结合大鼠脑组织抗氧化能力的改变，从而进一步分析高压氧对急性一氧化碳中毒大鼠脑组织抗氧化能力影响的可能分子机制。
　　实验目的：
　　1.探讨高压氧对急性一氧化碳中毒大鼠行为学的影响。
　　2.探讨高压氧对急性一氧化碳中毒大鼠脑组织抗氧化能力的影响。
　　3.探讨高压氧对急性一氧化碳中毒大鼠脑内Keap1-Nrf2-ARE通路的影响。
　　实验方法：
　　1.将114只SD大鼠采用随机数字表法分为正常对照组（normal control group）、CO染毒组（CO group）和高压氧治疗组（HBOT group）。
　　2.通过Morris水迷宫实验观察各组大鼠在1天（day，d）、3天（day，d）、7天（day， d）、14天（day，d）和21天（day，d）的行为学变化。
　　3.通过分光光度法分别测定各组大鼠脑组织在1d、3d、7d、14d和21d时总抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC），超氧化物歧化酶（superoxide dismutase， SOD），谷胱甘肽过氧化物酶（ glutathione peroxidase， GPX）、谷胱甘肽还原酶（glutathione reductase，GR）、过氧化氢酶（catalase，CAT）四种抗氧化酶的活性以及丙二醛（malondialdehyde，MDA）的浓度。
　　4.通过免疫组化染色法和Western Blot观察各组大鼠1 d、3 d和7 d时大脑皮层和海马组织Keap1和Nrf2的表达。
　　实验结果：
　　1.高压氧治疗可改善急性一氧化碳中毒大鼠的行为学异常
　　1）与对照组相比，染毒组（1 d、7 d、14 d、21 d）在Morris水迷宫定向航行实验中的逃避潜伏期显著延长（P＜0.05），在空间探索实验中的第一象限游泳时间明显缩短（P＜0.05）。
　　2）经过高压氧治疗后，治疗组（1 d、3 d、7 d、14 d、21 d）的逃避潜伏期较染毒组显著缩短（P＜0.05），第一象限游泳时间较染毒组明显延长（P＜0.05）。
　　2.高压氧治疗可提高急性一氧化碳中毒大鼠脑组织的抗氧化能力。
　　1）高压氧治疗可提高急性一氧化碳中毒大鼠脑组织的抗氧化酶活性。染毒组脑组织的T-AOC活性在染毒1 d、3 d、7 d、14 d和21 d时明显较对照组降低（P＜0.05）；其T-SOD活性和Cu-Zn SOD活性在染毒1 d、3 d、7 d、14 d和21 d时明显较对照组降低（P＜0.05）；其GPX活性在染毒1 d时明显较对照组降低（P＜0.05）；其GR活性在染毒1 d、3 d、7 d、14 d和21 d时明显较对照组降低（P＜0.05）；其CAT活性在染毒1 d时明显较对照组降低（P＜0.05）。经过高压氧治疗后，脑组织T-AOC活性在治疗3 d、7 d、14 d和21 d时明显较染毒组升高（P＜0.05），其T-SOD活性在治疗3 d、7 d、14 d和21 d时明显较染毒组升高（P＜0.05）；其Cu-Zn SOD活性在治疗7 d、14 d和21 d时明显较染毒组升高（P＜0.05）；其GPX活性在治疗1 d、3 d、7 d、14 d时明显较染毒组升高（P＜0.05）；其GR活性在治疗1 d和14 d时明显较染毒组升高（P＜0.05）；其CAT活性在治疗1 d、3 d和21 d时明显较染毒组升高（P＜0.05）。2）高压氧治疗可降低急性一氧化碳中毒大鼠脑组织脂质过氧化程度。染毒组脑组织MDA含量在染毒3 d、7 d和14 d时明显较对照组升高（P＜0.05）；高压氧治疗后，脑组织MDA含量在治疗3 d、7 d和14 d时明显较染毒组降低（P＜0.05）。
　　3.高压氧治疗可影响急性一氧化碳中毒大鼠脑内Keap1-Nrf2-ARE通路。
　　1）高压氧治疗对急性一氧化碳中毒大鼠脑组织Keap1的表达无规律性影响。免疫组化染色结果表明：在1 d和7 d时，染毒组大脑皮层的Keap1阳性细胞计数与对照组相比无统计学意义（P＞0.05），但在3 d时，其明显较对照组降低（P＜0.05）。在1 d和3 d时，染毒组海马组织的 Keap1阳性细胞计数与对照组相比无统计学意义（P＞0.05），但在7 d时，其明显较对照组升高（P＜0.05）。经过高压氧治疗之后，在3 d时，大脑皮层的Keap1阳性细胞计数较染毒组升高（P＜0.05），但在1 d和7 d时，其与染毒组相比无统计学意义（P＞0.05）。在高压氧治疗7 d时，海马组织的Keap1阳性细胞计数与染毒组相比降低，但是在1d和3d时，其与染毒组相比无统计学意义（P＞0.05）。Western Blot实验结果表明：在各时间点，染毒组大脑皮层组织和海马组织的Keap1蛋白的表达与对照组相比均无统计学意义（P＞0.05），与治疗组相比也均无统计学意义（P＞0.05）。
　　2）急性一氧化碳中毒降低大鼠脑组织Nrf2的表达。免疫组织化学染色结果表明：在1 d、3 d和7 d时，染毒组大脑皮层的Nrf2阳性细胞计数较对照组相比明显降低（P＜0.05）。其海马组织在染毒7 d时的Nrf2的阳性细胞计数较对照组降低（P＜0.05），在1 d和3 d时与对照相比均无统计学意义（P＞0.05）。通过Western Blot检测进入细胞核的Nrf2，实验结果表明：染毒组大脑皮层的Nrf2在1 d、3 d、和7 d时与对照组相比均无统计学意义（P＞0.05）。但是在海马组织，染毒组1 d时的Nrf2明显较对照组增加（P＜0.05）；3 d时的Nrf2与对照组相比无统计学意义（P＞0.05）；7 d时的Nrf2与对照组相比明显降低（P＜0.05）。
　　3）高压氧治疗可提高急性一氧化碳中毒大鼠脑组织 Nrf2的表达。免疫组织化学染色结果表明：高压氧治疗组大脑皮层和海马组织的Nrf2阳性细胞计数在1 d、3 d和7 d时与染毒组相比明显升高（P＜0.05）。通过Western Blot检测进入细胞核的Nrf2，实验结果表明：除高压氧治疗组1 d时海马组织的Nrf2表达低于染毒组外（P＜0.05），1 d时的大脑皮层以及其余时间点的大脑皮层、海马组织Nrf2的Western Blot结果与免疫组化的结果一致（P＜0.05）。
　　结论：
　　实验结果表明，高压氧治疗可显著改善急性一氧化碳中毒大鼠行为学异常，提高其脑组织抗氧化能力，Keap1-Nrf2-ARE通路的激活可能是其上述变化的机制之一。本研究为高压氧治疗减轻急性一氧化碳中毒大鼠脑组织氧化应激及其机制提供了新的实验依据。

目录

声明

缩略语表

前言

文献回顾

一、一氧化碳中毒对脑的影响

二、高压氧对CO中毒的治疗

三、Keap1-Nrf2-ARE通路与氧化应激

四、展望

第一部分 高压氧对急性一氧化碳中毒大鼠行为学及脑组织抗氧化能力的影响

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

第二部分 高压氧对急性一氧化碳中毒大鼠脑内Keap1-Nrf2-ARE通路影响的研究

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

小结

1.初步研究结果

2.研究创新点

3.研究展望

参考文献

研究成果

1. 个人简历

2. 攻读学位期间研究成果

致谢