细胞焦亡参与高氧治疗脓毒症作用机制的初步研究

摘要

脓毒症被定义为一种全身炎症反应综合征，由感染因素诱发，而严重脓毒症是指伴有器官功能障碍的脓毒症。在我国，脓毒症常常导致高死亡率和高治疗费用，已成为危害人类健康的主要疾病之一。因此，对于脓毒症的有效救治策略的寻找迫在眉睫！前期我们小组在离体和在体模型上均证实，对于脓毒症的治疗方面，100％氧起了保护效应，脓毒症后异常的炎性反应减弱，脂多糖刺激后NF-κB（Nuclear factor Kappa B，核因子-κB）核转位的水平降低，脓毒症之后部分的miRNA的上调也被逆转。脓毒症的发生发展过程中会伴随大量的细胞死亡，后者是导致过度炎性反应紊乱的主要原因之一，近年来，宿主细胞死亡与脓毒症之间关系的研究备受关注。细胞焦亡，或者称之为依赖于caspase-1的细胞死亡，本质上是由很多病理性刺激引起的炎症反应，这些病理性刺激包括中风、心脏病或者癌症。而细胞焦亡在脓毒症的发生发展和氧保护中的机制还未见研究，本研究拟在前期预实验的基础上，研究盲肠结扎穿刺（CLP，cecal ligation and puncture）所致小鼠脓毒症模型与细胞焦亡以及在高氧治疗脓毒症效应机制中的作用，并通过离体实验探索高氧治疗脓毒症效应中对NLRP3炎性小体炎症通路的相关调控方式，以此为高氧治疗脓毒症提供更多的实验依据，也将为寻找脓毒症治疗策略提供新的可能靶点。
　　研究目的：
　　探讨焦亡与脓毒症的关系以及焦亡与高氧治疗脓毒症效应的关系，并在骨髓源性巨噬细胞上验证40%、60%以及100%不同浓度的氧气对脓毒症的治疗效应。
　　材料与方法：
　　第一部分
　　实验1.将小鼠随机分为2组：Sham组和CLP组。CLP组动物使用盲肠结扎穿刺法建立脓毒症模型，Sham组动物只开腹，不实施盲肠结扎穿刺。24h后收集右下肺组织做Western Blot检测。观察指标：caspase-1活化片段P10与pro-caspase-1比值。
　　实验2.将小鼠随机分为4组：Sham组、CLP组、CLP+DMSO组、CLP+VX-765组。Sham组只开腹，后三组使用盲肠结扎穿刺法建立脓毒症模型。动物在CLP术后1.5h分别给予caspase-1抑制剂VX-765和DMSO。术后24h收集右下肺组织、肝组织右下叶和右肾做HE病理染色切片。
　　实验3.将小鼠随机分为6组：Sham组、Sham+100%Oxy组、CLP组、CLP+40%Oxy组、CLP+60%Oxy组、CLP+100%Oxy组。前两组只开腹，后四组使用盲肠结扎穿刺法建立脓毒症模型。治疗组在术后1h、6h分别给予40%、60%和100%氧吸入1h；非治疗组直接吸入空气。24h后收集血清检测炎性因子IL-1β水平。第二部分
　　实验1.培养小鼠骨髓源性巨噬细胞（BMDMs），随机分为4组：Control组、LPS组、ATP组、LPS/ATP组。LPS组单独给予LPS刺激24h；ATP组单独给予ATP刺激4h；LPS/ATP组使用LPS刺激细胞24h，再用ATP刺激细胞4h；Control组给予正常培养基。收集细胞培养上清液检测IL-1β水平。
　　实验2.培养小鼠BMDMs，随机分为6组：Control组、LPS组、ATP组、LPS/ATP组、LPS/ATP+YVAD组、LPS/ATP+DMSO组。刺激方法同实验1；LPS/ATP+YVAD组在ATP刺激之前用caspase-1抑制剂AC-YVAD-CMK刺激0.5h；LPS/ATP+DMSO组在ATP刺激之前用DMSO刺激0.5h。收集细胞培养上清液检测炎性因子IL-1β水平。
　　实验3.培养小鼠BMDMs，随机分为7组：Control组、LPS组、ATP组、LPS/ATP组、LPS/ATP+40%Oxy组、LPS/ATP+60%Oxy组、LPS/ATP+100%Oxy组。刺激方法同实验1。治疗组细胞在ATP刺激0.5h后即开始给予40%、60%或100%氧治疗1.5h。收集细胞培养上清液检测IL-1β水平。
　　实验4.实验分组同实验3。除ATP刺激1.5h之外其余刺激同实验3。治疗组细胞在ATP刺激后即开始给予40%，60%或100%氧治疗1.5h。ATP刺激1.5h后用EtBr和Hoechst33342荧光染色，荧光显微镜下观察焦亡小孔的数量。
　　实验5.培养小鼠 BMDMs，随机分为5组：Control组、LPS/ATP组、LPS/ATP+40%Oxy组、LPS/ATP+60%Oxy组、LPS/ATP+100%Oxy组。LPS/ATP组使用LPS刺激细胞24h，再用ATP刺激细胞2h。治疗组细胞在ATP刺激后即开始给予40%，60%或100%氧治疗1.5h。ATP刺激2h后，收集细胞用试剂盒检测细胞内钾离子的水平。
　　结果：
　　第一部分
　　实验1． CLP后24h，小鼠的右下肺组织细胞发生焦亡的程度明显高于Sham组（P＜0.05）。
　　实验2．CLP后24h，与Sham组相比，脓毒症小鼠肺、肝和肾脏发生显著病理性改变（P＜0.001）。与DMSO溶剂对照组相比，VX-765组的小鼠肺（P＜0.01）、肝和肾脏（P＜0.001）发生病理性改变的程度减轻。
　　实验3．CLP后24h，小鼠血清中IL-1β水平高于Sham组（P＜0.05），40%（P＜0.001）、60%或100%（P＜0.01）高浓度氧气干预后小鼠血清中IL-1β水平降低。第二部分
　　实验1．与Control组相比，LPS组和ATP组细胞培养上清液中IL-1β水平稍有升高，但无统计学意义。LPS/ATP组细胞培养上清液中IL-1β水平明显升高（P＜0.01）。
　　实验2.前四组结果同实验1。相比于LPS/ATP组，AC-YVAD-CMK组IL-1β水平明显降低（P＜0.001），DMSO组IL-1β水平明显升高（P＜0.001）。
　　实验3．前四组结果同实验1。相比于LPS/ATP组，60%和100%高氧干预组细胞培养上清液中IL-1β水平明显降低（P＜0.001）。
　　实验4．与Control组相比，LPS组和ATP组有焦亡小孔形成的细胞数量比例并无明显变化。LPS/ATP组有焦亡小孔形成的细胞数量比例明显升高（P＜0.001）。相比于LPS/ATP组，40%、60%或100%高氧干预组有焦亡小孔形成的细胞数量比例明显降低（P＜0.001）。
　　实验5．与Control组相比，LPS/ATP组细胞内钾离子的浓度无明显变化。相比于LPS/ATP组，40%、60%或100%高氧干预组钾离子的浓度无明显变化。
　　结论：
　　我们的研究结果表明：在小鼠脓毒症模型中有细胞焦亡参与组织损伤，高氧吸入可以通过减少焦亡小孔的形成降低细胞焦亡的发生，从而改善脓毒症的症状。

目录

声明

缩略语表

前言

文献回顾

一．脓毒症简介

二．高浓度氧

第一部分 探究细胞焦亡与脓毒症以及高氧治疗脓毒症的关系

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

第二部分 探究细胞焦亡参与高氧治疗脓毒症作用机制的初步研究

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

小结

参考文献

附录

个人简历和研究成果

致谢