Ese-3基因在皮肤鳞状细胞癌中的表达及其对人皮肤角质形成细胞HaCaT增殖的影响

摘要

背景： 皮肤鳞状细胞癌又称皮肤鳞癌，是较为常见的一类皮肤恶性肿瘤，主要发生于老年人，好发于手背、面部、头皮等光暴露较多部位。近年来，由于环境等多方面原因的影响其发病率呈逐年上升趋势，并且因其临床表现越来越多样,容易导致误诊而延误病情。Ese-3是ETS转录因子亚家族的一员，特异性地表达于前列腺，胰腺，唾液腺,气管等上皮细胞，通过ETS结合位点与目的基因启动子区域特异序列结合，增强或抑制目的基因的表达，进而影响细胞的周期、增殖、分化、侵袭、迁移、凋亡以及血管形成等生理过程。Giovanna Chiorino等研究发现，在前列腺癌中，Ese-3分子通过抑制上皮细胞间质转化和肿瘤干细胞形成过程中 TWIST1, ZEB2, BMI1,和POU5F1等基因的表达来抑制肿瘤的发展，而Ese-3表达缺失的前列腺癌患者更容易出现治疗后复发。但是也研究者发现，在卵巢癌中Ese-3过度表达促进癌症的发生发展，其表达升高提示预后不良，而沉默Ese-3分子表达后，卵巢癌细胞的增殖侵袭能力显著降低。因此，Ese-3对肿瘤的作用呈现出了组织依赖性，在前列腺癌、肺癌、食管癌中表达缺失，通过对不同分子的调控发挥抑癌作用，而在卵巢癌、乳腺癌中高表达，促进癌症的发展。但是在皮肤及皮肤肿瘤的发展中Ese-3的表达及其对下游基因调控作用未见报道。 目的： 通过免疫组化以及Western blot等试验方法检测Ese-3在皮肤鳞状细胞癌组织及细胞中的表达水平，进一步建立Ese-3基因敲减的永生化人角质形成细胞HaCaT细胞模型，检测Ese-3基因对HaCaT细胞克隆形成，增殖，凋亡等生物学特性的影响，初步探索Ese-3在皮肤鳞状细胞癌中的作用。 方法： 利用免疫组化方法检测Ese-3在皮肤鳞状细胞癌及癌旁组织中表达变化，Western blot检测Ese-3在鳞癌细胞A431及永生化人角质形成细胞HaCaT细胞中表达差异。通过Ese-3 sh RNA慢病毒系统感染HaCaT细胞，建立Ese-3基因敲减的稳转细胞系，通过MTT比色法、克隆形成、流式细胞术等方法检测Ese-3表达降低后HaCaT细胞增殖、凋亡、周期等生物学特性的变化。 结果： 1.免疫组化染色结果显示在21例正常皮肤组织中Ese-3呈阳性或强阳性表达，可见细胞核中呈棕黄色沉淀，而在51例皮肤鳞状细胞癌组织中，Ese-3呈弱阳性表达或表达缺失。根据染色程度及着色细胞比例进行评分，并用卡方检验进行统计学检验，两者差异较为显著 p＜0.05，说明Ese-3基因在皮肤鳞状细胞癌中表达降低或缺失。 2.Western blot检测Ese-3在皮肤鳞癌细胞A431中表达情况，结果显示Ese-3在A431细胞中表达降低，而在人角质形成细胞HaCaT细胞中正常表达。 3.Real-Time PCR实验和Western blot实验检测HaCaT细胞感染Ese-3 shRNA慢病毒后Ese-3在mRNA水平及蛋白水平变化情况。结果显示在4个靶基因位点中其中1号位点在mRNA及蛋白水平Ese-3敲减效率较高，达60%以上。 4. MTT比色法测定Ese-3基因敲减后HaCaT细胞与对照组细胞增殖情况，结果显示HaCaT Ese-3 Si细胞生长速度高于HaCaT CON细胞。 5.克隆形成实验结果显示，相较于对照组细胞，Ese-3基因表达降低后HaCaT细胞克隆形成能力增加。 6.流式细胞术检测细胞周期发现 Ese-3敲减后 HaCaT细胞生长受到促进，HaCaT细胞G0/G1期所占百分比为51.80%，S期为31.12%，而对照组HaCaT CON细胞G0/G1期为62.11%，S期21.77%，两者差异较显著；而流式细胞术检测细胞细胞凋亡发现，Ese-3基因敲减后HaCaT细胞与对照组细胞凋亡无明显差异。 结论： Ese-3在皮肤鳞状细胞癌组织及皮肤鳞癌细胞A431细胞中表达降低，在永生化的人角质形成细胞HaCaT细胞中降低Ese-3基因表达可促进HaCaT细胞增殖，克隆形成能力增加， S期细胞比例增加，提示 Ese-3基因表达缺失可通过促进细胞生长促进皮肤鳞状细胞癌的发生发展。

目录

声明

缩略语表

前言

文献回顾

一、皮肤鳞状细胞癌概况

二、ETS转录因子家族

三、Ese-3研究概况

第一部分Ese-3在皮肤鳞状细胞癌及癌旁组织中表达水平的检测

引言

1材料

2方法

3结果

4讨论

第二部分Ese-3 shRNA慢病毒包装、HaCaT细胞感染以及筛选

引言

1材料

2方法

3结果

4讨论

第三部分Ese-3基因对HaCaT增殖相关特性的影响

引言

1材料

2方法

3结果

4讨论

小结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢