组蛋白H2A去泛素化酶MYSM1对巨噬细胞功能的影响及其机制的初步研究

摘要

背景：
　　分布在各个组织中的巨噬细胞具有功能的多样性，在机体发育、组织稳态、固有免疫应答和组织损伤修复中都发挥重要作用。天然免疫是机体抵抗外来病原体入侵的第一道防线，分布于各个组织中的巨噬细胞作为功能最强的吞噬细胞，其表面表达多种受体识别外来的病原体产物，吞噬并加工处理后形成抗原肽-MHCII复合体发挥抗原提呈功能，活化的巨噬细胞产生大量氮氧化物介质包括NO和超氧化物杀伤侵入的病原体。巨噬细胞表达的多种模式识别受体可以识别病原体相关的模式分子，Toll样受体是其中一种重要的模式识别受体。巨噬细胞活化后启动细胞内的信号转导机制活化下游的转录因子表达多种促炎的细胞因子和趋化因子如肿瘤坏死因子、白细胞介素等参与固有免疫应答。巨噬细胞具有很强的异质性和功能的可塑性，经典激活的巨噬细胞在抵抗病原体感染和抗肿瘤中发挥作用，而替代活化的巨噬细胞在组织损伤修复中发挥作用。表观遗传学是指DNA序列没有发生改变而基因表达发生了稳定的、可遗传的变化，包括DNA甲基化、组蛋白的各种共价修饰和非编码RNA等修饰方式。越来越多的研究发现表观遗传学在调控巨噬细胞功能中发挥重要作用。组蛋白的翻译后修饰包括甲基化、乙酰化在调控巨噬细胞的炎性应答中都发挥了关键的作用，但是组蛋白的泛素化修饰在巨噬细胞介导的免疫应答中的作用还不清楚。组蛋白的去泛素化修饰是泛素化修饰的可逆过程，由去泛素化酶催化泛素链从底物蛋白上水解。MYSM1是一个组蛋白H2A的去泛素化酶，研究表明MYSM1对多种造血细胞和免疫细胞的发育、分化、成熟和功能都有影响，表明MYSM1是一个重要的表观遗传学分子，但是目前MYSM1对巨噬细胞的分化和功能有何影响尚不清楚。
　　目的：
　　明确MYSM1对髓系细胞的发育分化的影响以及对巨噬细胞功能的作用，探索可能的分子机制。
　　方法：
　　首先我们利用Cre-loxp系统繁育髓系条件性敲除MYSM1的小鼠，流式细胞术分析骨髓中、外周淋巴组织中髓系细胞的发育分化情况。在体外通过GM-CSF诱导骨髓细胞分化为骨髓来源的巨噬细胞，流式细胞术检测诱导的效率，Real-time PCR和Western blot检测诱导分化后的巨噬细胞中是否能有效地沉默MYSM1。通过流式细胞术检测抗原提呈功能，荧光微球实验检测吞噬功能，Transwell实验检测巨噬细胞的趋化能力，用不同的TLR激动剂刺激后Real-time PCR和ELISA检测巨噬细胞表达分泌的炎性因子和趋化因子的变化。通过腹腔注射LPS在体内建立急性腹膜炎模型证实MYSM1是否可以调控巨噬细胞分泌趋化因子募集中性粒细胞，3％DSS诱导的炎症性肠病动物模型明确MYSM1在体内的功能。Western blot检测LPS、poly(I:C)刺激后巨噬细胞胞核和胞浆中MYSM1的表达变化，Real-time PCR检测TLR信号通路中关键调控分子的表达变化，Western blot检测MYSM1对NF-kB和MAPK信号通路的影响。
　　结果：
　　流式细胞术发现MYSM1对骨髓中髓系细胞的发育没有影响，对外周免疫组织中粒细胞、单核细胞、巨噬细胞的分化成熟也无显著影响。GM-CSF成功诱导骨髓细胞分化为巨噬细胞，诱导效率达到95%以上，诱导后的巨噬细胞中MYSM1在RNA和蛋白水平都显著降低。MYSM1对巨噬细胞的抗原提呈能力无影响，可以促进巨噬细胞的吞噬功能，在体外抑制巨噬细胞的趋化能力。MYSM1可以抑制TLR3和TLR7活化后促炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α和I型干扰素的表达，抑制LPS和poly(I:C)刺激后趋化因子CXCL1、CXCL2、CXCL5的表达。在急性腹膜炎和皮下荷瘤模型中，MYSM1对巨噬细胞和单核细胞的趋化迁移无明显作用，但是抑制中性粒细胞的募集；在炎症性肠病模型中，MYSM1可以减轻炎性疾病的进展，表现为MYSM1缺失的小鼠体重下降更明显，结肠变短和炎性细胞的浸润更加显著。Western blot结果显示在LPS、poly(I:C)刺激后MYSM1的表达迅速升高并快速降低，胞浆中和胞核中的MYSM1都升高。qPCR检测TLR信号通路中负性调节分子的表达变化，发现过氧化物酶体增殖物激活受体γ受到MYSM1的调控，沉默MYSM1后PPARγ的表达降低，过表达MYSM1后PPARγ的表达增强。MYSM1可能通过表观遗传学机制调控PPARγ的表达，进而抑制MAPK信号通路中JNK、ERK的活化而抑制下游的信号转导从而抑制促炎因子和趋化因子的表达。
　　结论：
　　MYSM1对髓系细胞的发育分化成熟无影响，MYSM1促进巨噬细胞的吞噬功能，抑制TLR3和TLR7激活后促炎因子和I型干扰素的产生，并且能抑制趋化因子的分泌而影响中性粒细胞的募集，在体内MYSM1对巨噬细胞的迁移无影响，却可以抑制中性粒细胞的趋化募集而抑制炎性疾病的进展。机制研究发现MYSM1通过调控PPARγ的表达抑制MAPK信号通路的活化而发挥抑制巨噬细胞炎性应答的作用。

目录

声明

缩略语表

前言

文献回顾

1单核-巨噬细胞的发育分化与功能

2 表观遗传学调控

3 表观遗传学调控对固有免疫应答的作用

4 泛素化修饰和组蛋白的泛素化修饰

5 组蛋白H2A去泛素化酶MYSM1的研究进展

第一部分 髓系敲除MYSM1转基因小鼠的繁育与静息态分析

1实验材料

2实验方法

3实验结果

4 讨论

第二部分 MYSM1对巨噬细胞功能的影响

1实验材料

2实验方法

3 实验结果

4 讨论

第三部分 MYSM1作用分子机制的初步探讨

1 实验材料

2 实验方法

3 实验结果

4 讨论

小结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢