渐狭蜡蚧菌对南方根结线虫卵孵化抑制及其几丁质酶基因LACHI1的克隆

摘要

根结线虫(Meloidogyne spp(.))病是世界范围内发生的一种重要植物寄生线虫病害。传统的化学杀线剂会对环境造成严重污染且对人畜有害，化学药剂的大量使用使植物寄生性线虫抗药性随之加强，降低其防治效果。利用天敌真菌进行防治是植物根结线虫病害可持续治理的理想途径之一。 食线虫真菌是土壤中能够抑制植物寄生性线虫种群数量的重要微生物。本研究自黑龙江大豆孢囊线虫孢囊上分离到一株真菌CGMCC5328，通过形态学特征及ITS序列比较分析，鉴定该菌株为渐狭蜡蚧菌Lecanicillium attenuatum，该菌具有产生几丁质酶特性。利用NAG法测定渐狭蜡蚧菌CGMCC5328的几丁质降解酶系的活性在第4d达到酶活高峰，为16.90 U/mL;利用pNP法测定其外切几丁质酶活性显示该菌在第6d达到酶活高峰，为0.59 U/mL，直到第14d一直保持较高活性。活性电泳测定其几丁质酶分子量分别为79.6 kDa、65.6 kDa、54.1kDa、42.1 kDa和32.9 kDa。渐狭蜡蚧菌CGMCC5328不同浓度几丁质酶粗酶液处理南方根结线虫卵，其中第7 d100％浓度的几丁质酶粗酶液对卵孵化抑制率最大，可达83.17％。该菌接种南方根结线虫卵第6d的寄生率为85.10％。 克隆渐狭蜡蚧菌几丁质酶基因，为进一步明确该菌产生的几丁质酶对定居性根结类和孢囊类线虫卵孵化抑制作用提供理论依据。通过简并引物设计和RACE技术，克隆得到渐狭蜡蚧菌中的几丁质酶基因，利用生物学软件分析该基因序列及其编码的氨基酸序列。本研究首次从渐狭蜡蚧菌中克隆得到一个几丁质酶基因LACHI1，该基因DNA序列长1743 bp，含3个内含子，包含1272 bp开放阅读框，编码423个氨基酸，理论分子量45.9 kD，等电点5.90。LACHI1基因编码的几丁质酶，属于糖基水解酶18家族几丁质酶。同源性比对袁明该菌产生的几丁质酶与昆虫寄生真菌和食线虫真菌产生的几丁质酶有很高的同源性。 以上结果表明渐狭蜡蚧菌CGMCC5328具有高效产几丁质酶特性且能够寄生南方根结线虫卵，对南方根结线虫的生物防治具有重大应用潜力。

目录

声明

摘要

第一章 前言

1 根结线虫的习性与危害

2 根结线虫病害传统防治

2．1 农业防治

2．2 物理化学防治

3 根结线虫生物防治研究

4 渐狭蜡蚧菌L．attenuatum的研究进展

5 几丁质酶与根结线虫卵作用的研究

5．1 几丁质酶

5．2 几丁质酶基因

5．3 几丁质酶对根结线虫卵的影响

第二章 渐狭蜡蚧菌CGMCC5328的分离与鉴定

1 材料与方法

1．1 试验材料

1．2 试验方法

2 结果与分析

2．1 渐狭蜡蚧菌CGMCC5328的形态学鉴定

2．2 菌株rDNA-ITS序列分子鉴定和系统发育分析

3 结论

第三章 渐狭蜡蚧菌CGMCC5328对南方根结线虫卵孵化的影响

1 材料与方法

1．1 试验材料

1．2 试验方法

2 结果

2．1 渐狭蜡蚧菌对南方根结线虫卵的寄生

2．2 几丁质降解酶系活性测定

2．3 几丁质外切酶活性测定

2．4 几丁质酶活性染色

2．5 培养滤液对南方根结线虫卵孵化抑制的影响

3 结论

第四章 渐狭蜡蚧菌几丁质酶基因的克隆和系统发育分析

1 材料与方法

1．1 试验材料

1．2 试验方法

2．结果

2．1 LACHI1基因全序列的获得

2．2 LACHI1基因的生物信息学分析

2．3 不同真菌来源几丁质酶的系统发育分析

3．结论

第六章 讨论与展望

1 讨论

2 展望

参考文献

致谢

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