紫花苜蓿高效再生体系建立与农杆菌介导小反刍兽疫F基因转化研究

摘要

小反刍兽疫病毒（Peste des Petits Ruminants Virus，PPRV）是一种主要感染山羊、绵羊、美国白尾鹿等小反刍动物的一种病毒，主要于非洲西部、中部和亚洲的部分地区流行。在严重暴发时，死亡率为100％，在轻度发生时，死亡率不超过50%。它的重爆发也危机我国多个省份的畜牧业发展。该疾病尚无有效的治疗方法，防控的主要措施是通过疫苗免疫。随着转基因技术的发展，利用转基因技术生产植物疫苗受到了广泛的关注。F蛋白是组成病毒囊膜表面的一种纤突，是决定病毒感染成败的关键因素之一。它在病毒诱导细胞病理学方面发挥主要作用，能够诱导产生细胞溶血素、细胞融合以及启动病毒感染细胞的生物学活性。
　　紫花苜蓿（Medicago sativaL）是为欧亚大陆及世界各国广泛种植的一种优良饲料牧草，产量高，适口性强，营养丰富，再生性强，利用年限长。所以本实验以紫花苜蓿进行转基因技术研究。
　　本实验将构建好的含有F基因的表达载体检测并转化至农杆菌EHA105中，筛选阳性菌落，验证保存。用于接下来的农杆菌介导转化体系中。
　　本实验以赛特品种的子叶和下胚轴为外植体，通过诱导愈伤组织的形成，分化，建立高频的再生体系。研究不同培养基类型，不同浓度的激素对紫花苜蓿再生体系的影响。利用农杆菌介导法将已构建好的含有小反刍兽疫F基因的表达载体转化到紫花苜蓿中，研究了最佳侵染浓度和时间，最适Cef浓度和最适Kan浓度，以及共培养时间的研究，从而建立紫花苜蓿农杆菌介导遗传转化的体系。
　　主要结果如下：
　　(1)验证构建好的含有F基因的表达载体依然存在于保存的大肠杆菌DH5α中。转化构建好的含有F基因的表达载体到农杆菌EHA105中，并验证转化成功，保存菌液。
　　(2)赛特苜蓿最佳再生体系为：以MS为基础培养基，愈伤诱导最适2,4-D浓度为2mg/L，最佳KT浓度为0.25mg/L。愈伤分化最适NAA和KT的比例为，0.1mg/L NAA和0.5mg/L KT。
　　(3)确定了最适合的抑菌Cef浓度为500mg/L，最适合的筛选培养基Kan浓度为50mg/L。
　　(4)农杆菌介导转化时最佳侵染浓度为OD600=0.5，最佳侵染时见为10min，最佳共培养时间为3d。
　　(5)愈伤诱导培养基：MS+2mg/L2,4-D+0.25mg/L KT+500mg/L Cef+50mg/L Kan。最佳分化培养基:MS+0.1mg/L NAA+0.5mg/L KT+300mg/L Cef+50mg/L Kan
　　(6)农杆菌介导转化体系为：将预培养3d的外植体（子叶和下胚轴），放于OD600=0.5的农杆菌菌液中，侵染10min。共培养3d后，进行脱菌处理，后转移至MS+2mg/L2,4-D+0.25mg/L KT+500mg/L Cef上培养7d。脱菌结束后转移至含50mg/L Kan和300mg/L Cef的愈伤诱导培养基上进行诱导分化培养。每15d继代一次。
　　(7)获得抗性再生苗。

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第一章 前言

1.1 小反刍兽疫概述

1.2小反刍兽疫致病的分子基础

1.3 小反刍兽疫的诊断与防控

1.4小反刍兽疫疫苗的研究

1.5苜蓿转基因研究进展

1.6转基因技术在苜蓿中的应用

1.7转基因植物疫苗研究进展

第二章 菌种的活化以及重组质粒的鉴定

2.1 实验材料

2.2实验方法

2.3实验结果

第三章 重组质粒转化农杆菌EHA105及验证

3.1实验材料

3.2实验方法

3.3 实验结果

第四章 紫花苜蓿高频再生体系的建立

4.1材料与方法

4.2实验方法

4.3 结果与讨论

4.4讨论

4.5 小结

第五章 农杆菌介导小反刍兽疫F基因转化紫花苜蓿

5.1 材料与方法

5.2 实验方法

5.3实验结果

5.4 讨论与小结

第六章 结论

6.1重组质粒的鉴定及转化

6.2 赛特苜蓿高频再生体系的建立

6.3 农杆菌介导F基因转化苜蓿

参考文献

附录

致谢

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