山东部分地区水貂细小病毒病的确诊、VP2基因的克隆测序和分析及病毒分离鉴定

摘要

水貂细小病毒(Mink enteritis virus，MEV)在分类上属于细小病毒科(Parvoviridae)、细小病毒属(Parvovirus)，已在全世界多个国家迅速传播和蔓延，是目前公认的引起水貂病毒性肠炎和心肌炎的重大病原之一。水貂病毒性肠炎是一种急性、高度致死性传染病，具有感染率高、发病急、病程短、发病率高的特点。VP2蛋白是水貂细小病毒的主要衣壳蛋白，对病毒的宿主范围、组织嗜性、抗原性、血凝性等起重要作用。该蛋白中几个甚至一个氨基酸的突变都可能导致整个病毒的抗原性发生改变，因此对VP2基因的研究至关重要。本研究主要对在山东部分地区的水貂细小病毒病进行确诊，对水貂细小病毒进行分离鉴定，系统地分析VP2基因的变异情况，探索山东部分地区水貂细小病毒的流行趋势及分子基础，为该病的预防以及相关疫苗的研制打下基础。本文主要从以下三方面展开了相关研究：
　　试验一山东部分地区水貂细小病毒病的确诊
　　从山东潍坊、烟台、威海、青岛地区的水貂养殖厂收集样本，病貂出现血便、消瘦、发烧等症状，病理变化出现肠道出血，内容物呈现煤焦油状，粪便呈现血红色等现象为疑似病料，用胶体金试纸条检测，若为阳性，则用 PCR进一步确诊，对这些确诊病料收集并记录，为后续的VP2的测序分析和病毒的分离鉴定试验打好基础。
　　试验二山东部分地区水貂细小病毒VP2基因的克隆测序和分析
　　根据GenBank发表的MEV VP2基因序列用分子生物学软件设计1对引物，对PCR检测为阳性的样品扩增其VP2基因，将其与GenBank上公布的4株国内外MEV VP2基因、10株国内外的CPV-2a型的VP2基因、10株国内外的CPV-2b型VP2基因、1株国内的CPV-2c型VP2基因和8份国内外FPV VP2基因进行了相关比较,VP2基因的核苷酸序列同源性为97.6％-99.8%，氨基酸序列同源性为91.8%-99.7%。发育进化树表明各毒株的亲缘关系虽然较近，但也发生了一定的变异，不同毒株主要在87、101、267、297、300、324、426、440和555位氨基酸发生了替换。
　　试验三山东部分地区水貂细小病毒的分离鉴定
　　将处理好的阳性病料上清液接种于 F81细胞，进行盲传，盲传5代后出现明显的CPE，在接种后第5d出现80%以上病变时收毒，通过血凝血凝抑制试验（HA和HI）和PCR鉴定该分离病毒，结果表明该病毒能与CPV标准阳性血清产生凝集抑制；PCR测序结果和GenBank上的公布的MEV NS基因参考序列同源率高达98.5%；同时测定其TCID50为10-3.8/0.1mL。

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前言

文献综述

1 病原学研究进展

2 诊断技术研究进展

3 临床与病理学研究进展

4 水貂细小病毒的起源和进化

5 水貂细小病毒的传播

6 水貂细小病毒的致病机理

7 水貂细小病毒病的预防和控制

8 本研究的目的和意义

试验一 山东部分地区水貂细小病毒病的确诊

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

试验二 山东部分地区水貂细小病毒VP2基因的克隆测序和分析

1 材料和方法

2 结果与分析

3 讨论

试验三 山东部分地区水貂细小病毒的分离鉴定

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

全文总结

参考文献

缩略词表

致谢