寄生于南方根结线虫卵的长梗木霉几丁质酶基因TlChi46的克隆

摘要

植物病原线虫造成的土传植物病害对农业生产造成了相当大的经济损失。根结线虫病害频繁为害世界范围的蔬菜生产，尤其是我国保护地最常出现的土传植物病害。化学杀线剂已被广泛的用于线虫病害的治理，但化学杀线剂对土壤环境和人类健康的高毒性，已使得如溴甲烷等杀线剂已经或即将限制其在农业生产中的应用。采用生防真菌防治线虫的生物防治方法符合可持续治理的观念，正发展成为治理根结线虫的不可或缺的方法。
　　为进一步筛选高效寄生线虫真菌和阐明其寄生线虫卵的机理，本研究从湖北省烟草南方根结线虫卵分离到1株具高效生防潜力的菌株HBF1。形态学、rDNA-ITS和翻译延长因子tef1-α序列分析鉴定该菌为长梗木霉菌Trichoderma longibrachiatum，该菌是1株可以产生几丁质酶的南方根结线虫卵寄生真菌，其对南方根结线虫卵第10天寄生率为80.45％。分别采用NAG（N-乙酰葡聚糖胺）和pNP（对硝基苯酚）制作的标准曲线测定HBF1菌株分泌的几丁质降解酶系和外切几丁质酶的活性，这两者几丁质酶的活性在接种后的第10天分别达到最大为30.12和24.88μmol/h/mL。
　　为明确具体功能基因在长梗木霉菌株防治根结线虫病害中的重要作用，本文通过简并引物设计和RACE技术克隆其几丁质酶基因，分析该基因序列及与其他几丁质酶的同源性。本研究首次从长梗木霉HBF1菌中克隆到1个几丁质酶基因TlChi46，该基因DNA全长1793bp，含3个内含子和1个1272bp的开放阅读框，编码423个氨基酸，理论分子量45.9kDa，等电点5.23。同源性比对表明和昆虫寄生菌几丁质酶的亲缘关系较远。研究表明从长梗木霉HBF1中克隆得到的几丁质酶基因编码的几丁质酶的功能域可供进一步研究，高效产几丁质酶并有效寄生南方根结线虫卵的长梗木霉对南方根结线虫具有巨大的生防潜力。

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第一章 前言

1 根结线虫的习性及危害

2 线虫生活史和卵的结构

3 根结线虫病害防治的经济重要性

4 根结线虫病害传统防治存在的问题

5 根结线虫病害生物防治研究及应用进展

6 微生物几丁质酶基因克隆的研究

7 食线虫真菌几丁质酶基因克隆及调控

8 真菌几丁质酶对根结线虫卵孵化的影响

9 木霉几丁质酶基因克隆的研究进展

10木霉几丁质酶在植物病害生物防治中的应用

11长梗木霉菌T. longibrachiatum防治植物病原线虫的研究进展

第二章 长梗木霉菌HBF1的分离与鉴定

1 材料与方法

2 结果与分析

3 结论

第三章 长梗木霉菌株HBF1几丁质酶活性的产酶曲线

1 材料与方法

2 结果与分析

3 结论

第四章 长梗木霉菌株HBF1对南方根结线虫卵寄生作用的直接观察

1 材料与方法

2 结果与分析

3 结论

第五章 长梗木霉菌株HBF1几丁质酶基因的克隆

1 试验方法

2 结果与分析

3 结论

第六章 讨论与展望

1 讨论

2 展望

参考文献

导 师 组 意 见

致谢

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