乙酰化蛋白BcYak1在灰霉菌致病过程中的功能分析

摘要

由灰霉菌（Botrytis cinerea）引起的灰霉病害是蔬菜、水果种植上最为常见的一类病害，可侵染400多种经济作物，造成严重的经济损失。该病害不仅能引起田间损失，甚至在果实的储存、运输及零售环节都可以造成严重危害。由于灰霉病的这些特点，其造成的直接经济损失难以估量，在2012年被评为植物十大病原真菌之一，位列第二位。尽管国内外在灰霉的防治方面取得了一定的进展，但目前灰霉病最为有效的防治手段仍是化学防治，但是由于防治药剂数量有限、抗药性问题突出，该病害的防治极为困难。因此，针对灰霉菌致病机制的研究，以及开发新的药剂靶标对于灰霉病的防治具有重要意义。蛋白质乙酰化修饰是一种非常重要的蛋白修饰方式，已被证明在真核以及原核生物中广泛存在。目前乙酰化修饰在丝状真菌中报道较少，本研究首次对灰霉菌的乙酰化蛋白质组进行LC-MS/MS分析，共鉴定到954个蛋白中存在1582个乙酰化位点。后续生物信息学分析表明乙酰化蛋白分布于病菌细胞尤其是核糖体的各个组分，参与了次生代谢、转录、翻译等过程。更为重要的是，6个已报道的与致病性相关的蛋白也存在乙酰化修饰。这些结果表明，蛋白乙酰化修饰可能在灰霉菌的致病过程中起关键作用。
　　本研究对与灰霉菌致病性相关的乙酰化蛋白Bc Yak1在其致病及生长过程中的功能进行了分析。通过PEG介导的原生质体转化法对Bc Yak1基因进行了敲除和回补试验，并最终获得敲除突变体ΔBc Yak1和回补突变体ΔBc Yak1c。结果发现，与野生型灰霉菌株相比，敲除突变体ΔBc Yak1无论从生长速率、产孢、菌核量，还是对不同胁迫压力的敏感性方面均有显著地下降。更为重要地是，敲除突变体ΔBc Yak1在番茄叶片上的致病力几乎完全丧失，并且在洋葱表皮上的侵染能力也显著下降。而回补突变体ΔBcYak1c在上述方面与野生型灰霉菌株水平相当。结果将有助于揭示蛋白乙酰化修饰在病原菌侵染中的作用，拓展乙酰化修饰的生物学意义，并为丝状真菌中乙酰化研究提供线索，从而为挖掘潜在的药剂靶标和开发新型杀菌剂提供理论指导。

目录

声明

第一章 文献综述

1 灰霉病及灰霉菌

1. 1 灰霉病的症状及危害

1. 2 灰霉病的生物学概况

1. 3 灰霉病的发生规律

1. 4 灰霉病菌的侵染及致病机制

1. 5 灰霉病的防治

2 蛋白质的乙酰化修饰

2. 1 蛋白乙酰化的概念及功能

2. 2 乙酰化检测技术的发展

2. 3 蛋白乙酰化的研究现状

3 本研究的目的及内容

3. 1 研究目的及意义

3. 2 研究内容

3. 3 技术路线

第二章 灰霉菌乙酰化蛋白修饰分析

1. 材料与方法

1. 1 试验材料

1. 2 试验方法

2 结果与分析

2. 1 灰霉赖氨酸乙酰化蛋白及位点分析

2. 2灰霉赖氨酸乙酰化蛋白质组的特性分析

2. 3 灰霉赖氨酸乙酰化位点分布及结构分析

2. 4灰霉菌赖氨酸乙酰化蛋白互作网络分析

2. 5 灰霉菌中与致病性相关乙酰化蛋白的分析

3 小结与讨论

第三章 致病性相关乙酰化蛋白BcYak1的功能分析

1 材料与方法

1. 1 试验材料

1. 2 试验方法

1. 3 数据处理分析

2 结果与分析

2.1 灰霉菌BcYak1基因的生物信息学分析

2. 2 灰霉菌B cYa k1基因敲除及△Bc Yak1突变体的获得

2. 3△Bc Yak1突变体的回补及转化子鉴定

2. 4 突变体表型分析

2. 5 乙酰化位点的功能分析

2. 6蛋白亚细胞定位的研究

3 小结与讨论

第四章 全文总结

参考文献

致谢

作者简历

硕士期间科研学术成果