海湾扇贝和海紫杂交扇贝对鳗弧菌感染应答的转录谱分析

摘要

海湾扇贝属瓣鳃纲，异柱目，扇贝科，扇贝属，在我国海水养殖中占有重要地位，为山东、河北、辽宁等各省蓝色海洋经济的发展起到了巨大的推动作用，但最近这几年在扇贝育苗期间及外塘保苗过程中大量使用抗生素和农药，其势必导致细菌耐药性的提高，加之养殖环境的恶化，病害对扇贝造成的死亡问题日益突出，目前来看培育能够抵抗外界病原侵袭的扇贝新品种是解决我国扇贝健康养殖的一条重要途径。
　　本文以海湾扇贝和海紫杂交扇贝为研究对象，用不同浓度的溶藻弧菌、哈氏弧菌、鳗弧菌3种类型的弧菌侵染这两种扇贝，通过累积死亡率的分析，选取1种对扇贝较为敏感的弧菌，并为转录组测序取样实验确定适宜的注射浓度和取样时间点，取样后进行高通量测序分析。本研究通过比较海紫杂交扇贝与海湾扇贝自交一代扇贝在弧菌感染后抗病性上的差异来鉴定抗病相关基因和分子标记，并通过二代测序技术在整个转录组水平上对差异表达基因和分子标记进行鉴定分析，为这两种扇贝的功能基因组学和遗传育种研究提供基础和帮助。
　　弧菌感染实验发现，海湾扇贝和海紫杂交扇贝在经过浓度为1×106、1×107、5×107、1×108CFU/ml溶藻弧菌菌液感染后，在第7天的累积死亡率分别是3.33％、0.00%；6.67%、1.11%；17.78%、7.38%；18.89%、5.56%。注射对应相同浓度的哈氏弧菌菌液感染后，在第7天的累积死亡率分别是11.11%、3.33%；3.33%、1.11%；14.44%、13.33%；18.89%、7.78%。注射对应相同浓度的鳗弧菌菌液感染后，在第7天的累积死亡率分别是7.78%、3.33%；4.44%、1.11%；36.67%、8.89%；66.67%、37.78%。对照组海湾扇贝和海紫杂交扇贝注射 PBS缓冲液经过7天的累积死亡率分别为6.67%、5%。
　　通过实验观察，扇贝的累积死亡率随菌液浓度升高而增加，在相同的浓度下用鳗弧菌感染海湾扇贝和海紫杂交扇贝的死亡率要高于溶藻弧菌和哈氏弧菌，尤其在高浓度菌液侵染下对两种扇贝造成的死亡率更为显著，而哈氏弧菌的毒性稍大于溶藻弧菌。在相同的浓度的溶藻弧菌、哈氏弧菌、鳗弧菌菌液侵染中，海紫杂交扇贝的死亡率要显著低于海湾扇贝的死亡率，因此海紫杂交扇贝比海湾扇贝在对弧菌感染的抵抗防御方面表现出良好的杂交优势。根据海湾扇贝和海紫杂交扇贝在注射弧菌菌液后死亡率的统计分析，选择浓度为1.5×107CFU/ml的鳗弧菌作为测序取样时注射海湾扇贝和海紫杂交扇贝的菌种，并设置0h，12h作为取样点，分别取肝胰腺和肾脏样品用下一代测序技术进行转录组测序。
　　本研究通过Illumia Hiseq2500技术，对海湾扇贝和海紫杂交扇贝感染鳗弧菌前后的肝胰腺和肾脏进行转录组测序。通过筛选掉短序列共获得了512,745,722条高质量序列，用拼接软件Trinity对所得序列进行从头组装，共获得412,732条转录本，平均长度827 bp，N50长度为1511 bp。其中获得海湾扇贝235,625条转录本，平均长度1000 bp，N50分别为2002 bp；海紫杂交扇贝306,643条转录本，平均长度901 bp，N50为1724 bp。通过BLAST比对进行基因功能注释：23,715、25,230条unigenes分别被注释到UniProt和NR数据库中。
　　鳗弧菌侵染后，在海湾扇贝的肝胰腺中，差异表达的基因有473个，其中上调的基因有214个，下调的基因有259个；而海紫杂交扇贝的肝胰腺中，差异表达的基因有1116个，其中上调的基因有594个，下调的基因有522个；在海湾扇贝的肾脏中，差异表达的基因有243个，其中上调的基因有243个，下调的基因有181个；而海紫杂交扇贝的肝胰腺中，差异表达的基因有398个，其中上调的基因有192个，下调的基因有206个。对海湾扇贝和海紫杂交扇贝相同组织差异表达分析，以海湾扇贝作为参考，在海湾扇贝和海紫杂交扇贝肝胰腺中，差异表达的基因共有596个，其中上调的基因有311个，下调的基因有285个；而在肾脏中，差异表达的基因有482个，其中上调的基因有187个，下调的基因有295个。
　　依据差异表达基因的GO富集分析，筛选出组织蛋白酶L基因，肿瘤坏死因子相关蛋白基因、半乳糖凝集素9基因、C型凝集素基因、热休克蛋白90基因等5个表达差异极其显著的基因，这些基因可能是扇贝主要的免疫相关基因，从而为下一步的分子标记辅助育种打下基础。

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第一章 绪论

1.1 海紫杂交扇贝的研究现状

1.2 弧菌对贝类侵染的研究现状

1.3 高通量转录组测序研究概述

1.4 分子标记在水产中的应用

1.5 研究目的及意义

第二章 弧菌对海湾扇贝和海紫杂交扇贝的侵染实验

2.1 前言

2.2 材料与方法

2.3 实验结果

2.4 讨论

2.5 小结

第三章 海湾扇贝和海紫杂交扇贝对鳗弧菌免疫应答的转录谱测序分析

3.1 前言

3.2 实验材料

3.3 实验方法

3.4 结果

3.5 讨论

3.6 小结

结语

参考文献

致谢

作者简介

硕士期间撰写及发表的文章