基于均相生物传感策略的癌症标志物早期检测新方法

摘要

随着人类基因组计划的实施，基因诊断成为医学、分子生物学和遗传学研究中的重要课题。基于DNA碱基互补配对发展起来的各种DNA电化学传感技术具有信号灵敏、操作简便快速，能与DNA生物芯片兼容等优点，在基因检测中具有非常重要的应用价值。目前我国每年因癌症死亡人数约100万，约每6秒就有一人死于癌症。癌症早期诊断治愈率高如皮肤癌和宫颈癌，如果在癌症前期控制，治愈率接近100%。癌症早期会向血液中释放很少量的癌症标志物，因此要想早期诊断，必须有高灵敏度、高选择性生物传感方法。随着人们对DNA于蛋白质相互作用的深入研究，发现特定的DNA序列与相应蛋白质存在着特异性相互作用，这为癌症标志物的检测提供了新途径，使DNA生物传感器在癌症检测中产生重要的应用价值。
　　本文系统介绍了光致电化学生物传感器和DNA电化学生物传感器的基本组成，检测原理，分类和应用领域。然后重点介绍了DNA电化学传感器的设计，CdS量子点，石墨烯，重氮化-偶联反应在构筑DNA电化学生物传感界面中的应用。最后介绍了DNA逻辑门在生物传感器构筑中的应用。
　　基于一种新型的免酶免标记级联信号放大的策略建立了一种超灵敏免固定的光致电化学生物传感策略。此均相光电化学放大策略是基于催化发卡自组装和杂交链式反应相结合的目标物循环放大。当存在目标物CEA时，就会首先发生催化发卡自组装反应，产生的双链复合物又会引发杂交链式反应。产生的双链DNA在钾离子与hemin的作用下产生大量的G四链体DNA酶，能够催化4-氯-1-萘酚生成沉淀沉积到电极表面引起光电流的急剧降低。在最优化的实验条件下，此光电化学生物传感器能够超灵敏检测到atto-gram级别的目标物。此基于适配体级联放大的策略不仅能够提高目标物的选择性和灵敏性，而且也能够通过设计不同的适配体序列来超灵敏检测不同种类的蛋白质。基于这种免酶免标记的光致电化学生物传感器可以检测不同种类蛋白质,对于临床诊断也有重要的潜力。
　　基于石墨烯能够区分单双链DNA的作用，使用石墨烯修饰玻碳电极作为传感平台,利用电化学阻抗的方法设计了一种新型的免标记均相电化学生物传感器。通过电化学信号的变化来特异性的检测目标物，设计了一种新型的以适配体为开关的双向DNA聚合策略，实现了目标物的循环和信号的指数放大。在该策略中，所设计的DNA结构均能吸附到石墨烯修饰的玻碳电极表面，作为电化学阻抗信号输出，当目标物存在时，引发此聚合反应，形成很长的DNA双链结构，远离电极表面。通过反应前后电化学阻抗的不同，能够做到免标记的检测到femto-gram级别的目标物。此方法不仅提供了一种新型的电化学生物传感平台而且在生物学的研究和临床诊断方面提供了重大的应用潜力。
　　众所周知，石墨烯能够区分单链DNA和双链DNA，基于这种特性可以用来制备基于石墨烯的DNA生物传感器。在此工作中，我们设计了一种以石墨烯修饰的玻碳电极作为生物传感平台，用均相电化学的方法来检测目标物的策略。当存在目标物时，所设计的亚甲基蓝标记的发卡探针就会发生构型的改变，同时被T7核酸外切酶识别，再经过循环放大就会产生大量的亚甲基蓝标记的长单链DNA。通过检测反应前后玻碳电极表面亚甲基蓝DPV信号的不同来特异性的检测目标物。同时利用凝胶电泳的方法来表征此循环放大实验的可行性。
　　基于新型的免标记的均相电化学生物传感平台，利用DNA聚合和切割反应设计了八大基础逻辑门（OR,NAND,AND,NOR,INHIBIT,IMPLICATION,XOR,和XNOR）。以单链DNA做为目标物输入引发或阻止DNA的聚合或切割来产生大量的G四链体结构作为信号输出单元。产生的G四链体能够和亚甲基蓝有较强的相互作用，有效降低亚甲基蓝的扩散电流，同时作为逻辑门的信号输出和高灵敏检测目标物的作用。此实验第一次实现了利用均相电化学的方法来构建逻辑门。并且，通过设计不同的DNA聚合和剪切的序列可以用来检测不同种类的目标物。

目录

声明

第一章 前 言

1.1肿瘤标志物研究进展

1.2 DNA 电化学生物传感器

1.3 核酸扩增技术

1.4 本论文研究目的和意义

第二章 基于催化发卡自组装和杂交链式反应结合的光致电化学检测癌胚抗原

2.1 引言

2.2 实验部分

2.3结果和讨论

2.4 结论

第三章 基于适配体变构双向DNA聚合免标记石墨烯辅助均相电化学检测CEA

3.1 引言

3.2 实验步骤

3.3 结果和讨论

3.4 结论

第四章 基于石墨烯介导T7核酸外切酶辅助循环放大策略检测癌胚抗原

4.1 引言

4.2 实验部分

4.3 结果和讨论

4.4 结论

第五章 均相电化学逻辑生物运算新技术研究

5.1 引言

5.2 实验部分

5.3 结果和讨论

5.4 结论

第六章 总结与展望

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间发表的学术论文及获奖情况