金纹细蛾Ⅰ型几丁质酶的表达、纯化及酶学活性测定

摘要

几丁质由N-乙酰氨基葡萄糖残基通过β-1，4糖苷键结合而成的直链多聚物，是昆虫外骨骼、肠道、气管及围食膜等的主要组成成分。昆虫几丁质酶是一种能够将几丁质水解成为寡聚物的内切酶，广泛存在于昆虫的中肠、蜕皮液及某些昆虫的毒腺中，在昆虫的生长发育过程中精确的调节着几丁质的代谢。目前，昆虫几丁质酶主要应用在病虫害防治、疾病控制及几丁质生物垃圾的降解等方面。
　　 本研究首次将金纹细蛾Ⅰ型几丁质酶(LrCHT5)基因分别构建到原核表达载体pRSET-C、pET28a、pET32a及pMAL-s上，进行原核载体的筛选，期望能够获得表达可溶性蛋白的载体。利用分子生物学常规实验方法构建重组载体，将其分别转化到相应的表达感受态中，利用IPTG进行诱导，SDS-PAGE电泳分析结果表明构建的重组BL-pET28a-LrCHT5及BL-pET32a-Lr CHT5表达的蛋白以包涵体形式存在，重组BL-pRSET-LrCHT5没有表达出目的蛋白，重组BL-pMAL-LrCHT5表达出110kDa左右的可溶性融合蛋白MBP-Lr CHT5。Western blot检测结果进一步证明重组BL-pMAL-LrCHT5菌表达出可溶性融合蛋白。为了使融合蛋白能够高效表达，本研究对重组pMAL-LrCHT5菌液的表达条件进行优化，最佳表达条件最终优化为菌液OD值为0.778，诱导剂IPTG浓度为0.5 mmol/L，诱导的过程中采用16℃过夜诱导。对于表达的MBP-LrCHT5蛋白采用4℃与Amylose柱过夜结合进行纯化，SDS-PAGE电泳分析结果显示纯化出纯度较高的MBP-LrCHT5融合蛋白。利用胶状几丁质及4MU-(GlcNAc)3作为底物均未检测到活性。
　　 由于重组BL-PMAL-LrCHT5表达的融合蛋白MBP-LrCHT5在纯化的过程中及生物学活性方面存在问题，本研究将LrCHT5基因构建到载体pFastBacTMDual上，进一步转化入DH10Bac感受态中，获得重组穿梭载体Bacmid-LrCHT5，利用脂质体介导转染Sf9细胞并进行细胞表达。由于LrCHT5本身含有信号肽区，所以在表达的过程中分泌到细胞培养液中。表达结束后，对培养液进行收集透析，利用Ni-NTA柱进行蛋白分离纯化，SDS-PAGE电泳分析结果显示纯化得到单一条带的纯化蛋白。
　　 本研究对原核和Sf9细胞表达的目的蛋白进行酶学活性检测。利用4MU-(GlcNAc)3作为底物，结果显示，原核表达的融合蛋白不具酶学活性，Sf9细胞表达的目的蛋白的比活力为2.917U/μg，最佳温度为50℃左右，最佳pH为6.0。高浓度的金属离子Mn2+、Ca2+、Mg2+及Ba2+对LrCHT5蛋白具有不同程度的促进作用，Cu2+对酶有较强的抑制作用，SDS酶的抑制作用最强。通过对LrCHT5蛋白的动力学参数测定结果显示Km为14.2μm/L，Vmax值为0.905μM/min。另外，对纯化的LrCHT5蛋白进行抑菌实验研究，结果表明LrCHT5蛋白对青霉及酵母分别存在不同程度的抑制作用。本课题深入研究了LrCHT5的生化性质，为LrCHT5功能研究奠定了基础，同时为金纹细蛾的生物学防治提供理论依据。

目录

声明

摘要

第一章 文献综述

1．1 有关金纹细蛾的介绍

1．2 昆虫几丁质及几丁质酶的介绍

1．2．1 几丁质

1．2．2 昆虫几丁质酶的类型及分类

1．2．3 昆虫几丁质酶的结构域及功能

1．2．4 昆虫几丁质酶的应用

1．3 几丁质酶活性测定方法

1．4 本论文的研究目的和意义

1．5 本研究课题的来源和主要内容

第二章 金纹细蛾Ⅰ型几丁质酶的原核表达及纯化

2．1 引言

2．2 材料及菌株

2．2．1 相关试剂及工具酶

2．2．2 相关试剂及缓冲液的配制

2．2．3 表达载体及菌株

2．2．4 主要设备及仪器

2．3 实验方法

2．3．1 重组载体的构建

2．3．2 表达条件的优化

2．3．3 融合蛋白的纯化

2．4 结论

2．4．1 原核表达重组载体的构建

2．4．2 表达条件的优化

2．4．3 融合蛋白的纯化

2．5 讨论

第三章 金纹细蛾Ⅰ型几丁质酶在Bac-to-Bac细胞表达系统中的表达及纯化

3．1 引言

3．2 相关材料及试剂

3．2．1 菌株及质粒

3．2．2 药品与试剂

3．2．3 溶液的配制

3．3 实验方法

3．3．1 LrCHT5基因的克隆及纯化

3．3．2 供体质粒pFastBac-LrCHT5的构建及检测

3．3．3 重组穿梭载体Bacmid-LrCHT5的构建及鉴定

3．3．4 重组杆状病毒的获得及鉴定

3．3．5 LrCHT5-(His)6的表达及纯化

3．4 结论

3．4．1 LrCHT5目的基因的扩增及纯化

3．4．2 重组穿梭载体Bacmid-LrCHT5的构建及鉴定

3．4．3 重组杆状病毒的获得及鉴定

3．4．4 目的蛋白的表达

3．4．5 LrCHT5蛋白的纯化及纯度的检测

3．5 讨论

第四章 酶学活性测定

4．1 引言

4．2 相关材料及试剂

4．2．1 菌株及试剂

4．2．2 溶液的配制

4．3 实验方法

4．3．1 4MU标准曲线的绘制

4．3．2 蛋白标准曲线的浓度的绘制

4．3．3 酶活力的测定

4．3．4 最适pH及pH稳定性测定

4．3．5 最适温度及热稳定性测定

4．3．6 动力学分析

4．3．7 金属离子及有机化合物对酶活力的影响

4．3．8 LrCHT5的抑菌活性检测

4．5 结论

4．5．1 4MU标准曲线的绘制

4．5．2 蛋白浓度的测定

4．5．3 最适pH及pH稳定性测定

4．5．4 最适温度及热稳定测定

4．5．5 动力学分析

4．5．6 金属离子及有机化合物的影响

4．5．7 LrCHT5抑菌活性的检测

4．6 讨论

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间发表的论文与专利