周期性机械拉伸对人真皮成纤维细胞增殖及胶原蛋白代谢的影响

摘要

皮肤创面愈合是一个复杂而有序的动态生物学过程，依赖于成纤维细胞与细胞外基质间的相互影响、相互作用。正常生理状态下，人真皮成纤维细胞处于皮肤张力作用下，成纤维细胞的增殖、分化、胶原蛋白代谢及基因表达等生物学过程都与其所处的力学环境有关。了解与调控张力作用下成纤维细胞的生物学行为是促进伤口愈合、提高愈合质量、预防瘢痕异常增生等皮肤疾病及慢性难愈性创面的基础与关键。体外研究周期性机械应力刺激对成纤维细胞生物学行为的影响，有助于进一步了解皮肤创面愈合的生物学机制，为皮肤疾病的治疗方法及评估提供重要参考。本实验通过FX-4000柔性基底应变加载系统对人真皮成纤维细胞进行力学环境培养，研究力学刺激对成纤维细胞增殖及胶原蛋白基质代谢的影响，主要研究内容及结论如下:
　　1.采用胶原酶消化法原代提取与培养人真皮成纤维细胞，以3×104/ml密度接种于裱衬Ⅰ型胶原蛋白的柔性细胞6孔培养板，采用FX-4000柔性基底应变加载系统对人真皮成纤维细胞施加频率为0.1Hz、拉伸幅度分别为10％和20％的周期性机械拉伸，并于拉伸后24h和48h提取细胞mRNA、收集细胞及细胞培养液上清，以无压力培养为静态对照。
　　2.采用流式细胞仪检测细胞周期，分析S期占整个细胞周期的百分比，S期代表细胞增殖特性，S期所占百分比越高，表明细胞增殖越旺盛。实验结果表明:与静态对照组比较，10％拉伸幅度作用24h后，S期占细胞周期的比例显著增高，随着时间的推移，48h，S期占细胞周期的比例降低。成纤维细胞能够对0.1Hz、拉伸幅度10％、拉伸24h的力学刺激作出反应，改变细胞周期，促进成纤维细胞增殖，拉伸48h后反而下降。
　　3.周期性机械拉伸后，提取细胞内总RNA，收集细胞培养液上清，采用实时荧光定量PCR方法研究各组成纤维细胞内Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白mRNA的表达;ELISA方法检测各组上清液中Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白的浓度。实验结果表明:10％拉伸幅度作用24h、48h及20％拉伸幅度作用24h均可以促进成纤维细胞Ⅰ型胶原蛋白mRNA的表达;10％拉伸幅度作用24h、48h均可以促进Ⅲ型胶原蛋白mRNA的表达;10％拉伸幅度作用48h及20％拉伸幅度作用24h、48h均可以促进细胞培养液上清中Ⅰ型胶原蛋白的合成;10％拉伸幅度作用24h及20％拉伸幅度作用24h、48h均可以促进细胞培养液上清中Ⅲ型胶原蛋白的合成。力学刺激能够影响细胞外基质Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白的代谢，且与力学刺激的幅度和时间有关。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1．1 皮肤的组织结构

1．2 真皮细胞及细胞外基质

1．3 力学刺激对成纤维细胞的影响

1．4 本文的主要研究内容

第二章 实验技术

2．1 人皮肤成纤维细胞的原代提取与培养

2．1．1 主要试剂与仪器

2．1．2 实验方法

2．1．3 实验结果

2．2 FX-4000柔性基底应变加载技术

2．2．1 FX-4000细胞牵张拉伸应力加载分析系统的组成

2．2．2 FX-4000细胞牵张拉伸应力加载分析系统的工作原理

2．2．3 细胞加载方案

2．3 流式细胞仪

2．3．1 流式细胞仪的基本结构

2．3．2 流式细胞仪检测细胞周期的工作原理

2．3．3 流式细胞仪检测技术的应用

2．4 实时荧光定量PCR技术

2．4．1 实时荧光定量PCR技术的概论

2．4．2 实时荧光定量PCR技术原理及应用

2．5 酶联免疫吸附技术

2．5．1 ELISA方法概论

2．5．2 ELISA技术的基本原理

2．5．3 双抗夹心法ELISA原理

2．6 本章小结

第三章 周期性拉伸应力对成纤维细胞细胞周期的影响

3．1 细胞周期

3．2 主要试剂与仪器

3．3 实验方法

3．4 实验结果

3．5 本章小结

第四章 周期性拉伸应力对成纤维细胞胶原合成的影响

4．1 细胞内蛋白mRNA的表达

4．1．1 主要试剂与仪器

4．1．2 实验方法

4．1．3 实验结果

4．2 上清液中胶原蛋白含量的检测

4．2．1 主要试剂与仪器

4．2．2 实验方法

4．2．3 实验结果

4．3 本章小结

第五章 全文工作总结及展望

5．1 全文工作总结

5．2 后续研究展望

参考文献

致谢

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