人神经元特异性烯醇化酶的基因克隆及单克隆抗体的制备和鉴定

摘要

神经元特异性烯醇化酶(Neuron-specific enolase,NSE)是烯醇化酶的一种同工酶.γγ、αγ组成的同工酶为神经元和神经内分泌细胞特有,故命名为神经元特异性烯醇化酶.NSE基因核苷酸序列全长2423bp,开放读码框架从第226到1531个碱基,长度为1305bp,编码全部434个氨基酸.目的本研究的目的是通过克隆序列正确的人神经元特异性烯醇化酶(NSE)基因,表达蛋白,制备出鼠抗人神经元特异性烯醇化酶(NSE)的单克隆抗体,以便为检测肿瘤细胞或组织中NSE抗原提供一种有效的工具.方法首先利用NSE特异引物,通过RT-PCR从人肺癌细胞株A549中扩增人NSE分子的cDNA全长.与pGEM-T载体连接转化大肠杆菌JM109,构建重组质粒pGEM-T-NSE.重组质粒测序鉴定基因序列,然后将NSE基因定向克隆于原核高效表达载体pMS-31b,转化大肠杆菌POP21 36经42℃热诱导获得MS2-NSE融合蛋白.融合蛋白经SDS-PAGE电泳分离、电洗脱、PBS透析纯化后,免疫BALB/C小鼠.应用常规杂交瘤技术,通过ELISA双筛,筛出能分泌抗人NSE单克隆抗体(NSE McAb)的杂交瘤细胞株并进行体内培养制备腹水.检测其分泌抗体的亚型,据亚型选择不同的纯化方法纯化.然后用细胞化学、特异性、Western-blot等方法鉴定制备抗体的免疫反应及特异性.以自制的NSE McAb采用IHC技术检测NSE在人肺癌细胞A549、BE1(高转移)、LH7(低转移)以及肝癌细胞7402中的表达.结果本研究克隆了人神经元特异性烯醇化酶基因,测序结果证明克隆的NSE基因序列完全正确,获得了2株能稳定分泌抗NSE单克隆抗体的杂交瘤细胞株,制备了抗NSE的单克隆抗体,经检测其分泌抗体的亚型分别为IgG1和IgG2a.细胞化学结果表明NSE在肺癌细胞A549、BE1(高转移)、LH7(低转移)以及肝癌细胞7402中均表达于胞浆.结论本研究制备了抗NSE单克隆抗体,初步检测了NSE在肿瘤细胞中的表达情况,为以后进一步研究NSE的功能奠定了基础.

目录

文摘

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缩略语表

第一章实验材料

1.1寡核苷酸引物设计及合成

1.2表达载体、菌株及分子克隆试剂

1.3细胞株、细胞培养相关试剂

1.4实验动物

第二章主要溶液及试剂配制

2.1 RNA提取用试剂

2.2 DNA分析用试剂

2.3碱变性法质粒DNA提取溶液

2.4 DNA回收试剂购自天为时代有限公司（树脂结合方法）

2.5细菌培养用试剂

2.6蛋白质分析用试剂

2.7细胞培养相关试剂

2.8用于抗体检测的试剂

2.9用于抗体亚类鉴定试剂（购自Sigma公司）

2.10用于抗体纯化的试剂

2.11辣根过氧化物酶标记纯化抗体IgG所用试剂

2.12用于抗体鉴定的试剂(Western blot法)

2.13细胞化学试剂

第三章主要仪器与设备

第四章NSE的基因克隆及重组质粒的构建

4.1人肺癌细胞A549的培养

4.2 TRIZOL法提取肺癌细胞A549总RNA

4.3 RT-PCR扩增NSE目的基因

4.4 NSE-PCR产物的纯化及回收

4.5回收后的NSE加“A”尾

4.6 NSE加“A”尾后与pGEM-T载体连接

4.7 CaCl2感受态细菌JM109的制备及连接产物的转化

4.8 pGEM-T-NSE质粒DNA的小量制备及内切酶消化鉴定

第五章原核表达载体pMS-NSE的构建

5.1原核表达质粒载体pMS-31b DNA的大量制备

5.2质粒pGEM-T-NSE及pMS-31b DNA的酶切

5.3酶切片段的回收

5.4 pMS-31b与NSE连接

5.5 CaCl2法制备感受态细菌POP2136及连接产物的转化

5.6pMS-NSE质粒DNA的小量制备及内切酶消化鉴定

第六章MS2-NSE融合蛋白的诱导表达、纯化及鉴定

6.1 MS2-NSE融合蛋白的诱导和表达

6.2 MS2-NSE融合蛋白的大量制备、纯化及鉴定

第七章抗NSE单克隆抗体的制备

7.1抗原

7.2动物及动物免疫

7.3小鼠免疫方法

7.4细胞融合

7.5阳性克隆筛选及亚克隆

7.6抗NSE McAbs亚类测定

第八章抗NSE单克隆抗体的纯化和酶标

8.1小鼠杂交瘤腹水的制备及收集

8.2单克隆抗体的纯化

8.3辣根过氧化物酶(HRP)标记纯化NSE McAb(IgG2a)

第九章 抗NSE单克隆抗体的鉴定

9.1 10％SDS-PAGE电泳鉴定纯化的抗NSE McAb

9.2纯化抗NSE McAb效价的测定

9.3 HRP-NSE McAb效价的测定

9.4抗NSE McAb特异性检测

9.5 Western blot检测NSE在肿瘤细胞中的表达

9.6细胞化学方法检测NSE在肿瘤细胞株中的表达

第十章实验结果

10.1 NSE的RT-PCR扩增及重组质粒的构建

10.2 MS2-NSE融合蛋白的表达和纯化

10.3小鼠抗人NSE McAb的制备、纯化及鉴定

第十一章讨论

第十二章小结

参考文献

附录

综述

个人简历

致谢