Notch在小鼠神经管畸形形成中的作用及分子机制的初步研究

摘要

本文分两部分研究了Notch在小鼠神经管畸形形成中的作用及分子机制。 第一部分：探讨Notch信号在正常神经上皮发育及神经管发育过程中的作用，试图揭示Notch信号通路在神经管畸形发生过程中的分子机制，为进一步探讨Noah信号在胚胎神经系统发生和发育过程中的作用及可能的机制提供实验依据。 研究方法： 采用全胚胎原位杂交技术观察到Notch在正常胚胎早期发育中时空表达规律，尤其在神经胚形成阶段；利用喂服过量全反式维甲酸(alltransretinoic acid，ATRA)诱导NTDs模型，观察NTDs的胚胎早期发育过程中Notch的表达变化；采用RT-PCR技术检测Notch信号调节的发育相关基因在正异常鼠胚的表达；并利用Western b16ts观察Notch蛋白的胞内活性形式NICD(the intracellular domain of Notch)胚胎早期发育中的变化。 研究结果： 一、Notch在小鼠神经胚发育中的表达采用全胚胎原位杂交可观察到在小鼠胚胎发育的9.5～11.5天(E9.5d～E11.5d)NotchmRNA的表达情况，阳性反应物成黄绿色。在E9.5d随着神经管的逐渐关闭，Noah mRNA在前脑泡有表达，尾部也有少许表达，到E10.5d，阳性信号由前脑泡转移至中脑泡乃至整个脊柱，E11.5d时在整个脑泡以及脊柱中仍有Noah mRNA的表达，但表达强度不如E10.5d的强。 二、Notch与ATRA致小鼠NTDs的关系与正常对照组相比，喂服ATRA后的孕鼠在E9.5～10.5d可观察到前脑顶部和后脑未闭合的畸形胚胎，在少数胚胎可观察到整个神经管未闭合，呈开放状态。表明该剂量的ATRA(50mg/kg)可以造成CNS发育的缺陷。 与正常鼠胚相比，ATRA致NTDs鼠胚在E9.5d Noah mRNA的表达量要比正常的鼠胚明显增多，而且表达部位也有增加，不仅在前脑泡有表达，在未完全形成的脊柱上也有表达；E10.5d Notch mRNA.的表达量较正常鼠胚减少，在脑泡Notch mRNA表达的阳性信号要弱于正常鼠胚；E11.5d胚胎神经管关闭，Noah mRNA的表达与正常鼠胚相比无论表达量还是表达部位都没有明显变化。 三、Notch信号调节的发育相关基因的表达通过凝胶图像分析，计算所得灰度比值来反映各基因mRNA的表达，将对照组(正常神经管组织)和NTDs组行两样本t检验，得出NTDs组与对照组组内各样本间无差异(P>0.05)：E9.5d时Notchl在NTDs组表达高于对照组(P<0.05)，其它三个基因RBP-Jk、PS1、Hes1在NTDs组和对照组间无统计学意义：E10.5d时Notchl和RBP-Jk的表达在对照组和NTDs组没有统计学意义(P>0.05)，而PSl和Hes1的表达存在差异，PS1和Hes1在NTDs中的表达明显低于对照组，具统计学意义(P<0.05)；E11.5d，四个基因均未有差异表达。在正常神经管组织中，胚胎发育不同时间(E9.5-11.5d)Notchl的表达在E10.5d高于E9.5d，但与E11.5相近；RBP-Jk的表达在E10.5d高于E9.5d和E11.5d；Hes1的表达也是如此；而PS1随天数表达增加；在ATRA致小鼠NTDs神经管组织中，Notch1和RBP-Jk的表达在E9.5-11.5d几天内没有较大的变化；PS1的表达在E9.5-11.5d内，降低后增高，Hesl的表达也是先降低后增加。 四、Notch蛋白胞内区NICD的定量采用凝胶成像及分析系统，于可见光下采集蛋白条带图像，通过与相应内参GAPDH条带密度比较，计算各个条带密度相对比值。以此比值来反映NICD蛋白的表达量。对所获得的数据采用SPSS 11.5统计学软件进行统计学处理。将各期对照组(正常脑组织)和NTDs组行两样本t检验，得出E9.5d时NICD的表达没有统计学意义P>0.05，而E10.5d时NICD蛋白表达在同期对照组和NTDs组有显著差异P<0.05，到E11.5d时核内NICD的变化不大，没有差异。免疫组化显示Notch胞内区NICD在神经管周围神经上皮中有表达。 第二部分：探讨山西省汉族人群MTHFRC677T、RFC-1A80G基因多态性状况及与神经管畸形(Neural Tube Defects简称NTDs)的相关性，明确山西神经管畸形发病的危险因素，为预防和控制NTDs发生提供科学的依据。 研究方法： 采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性方法(PCR-RFLP)分析38例曾经生育过NTDs.儿妇女和80例正常对照的MTHFRC677T和RFC-1A80G多态性分布。根据VanAllen's分类法将神经管畸形分为高畸形组(包括腰椎或腰骶脊柱裂)和低畸形组(包括无脑，枕部脑膨出)。 研究结果： 1.病例组与对照组相比：MTHFR基因677位点基因型频率没有差别；并且二者在等位基因频率上也无显著差异。但是在生育低畸形儿母亲组T等位基因频率高于对照组，具有统计学意义(OR=0.32(95％CI 0.11-0.9)，p=0.027)；677T/T基因型频率在生育低畸形儿组与对照组中没有显著差异p=0.08。 2.病例组与对照组相比：RFC-180位点基因型频率存在统计学意义，OR=8.85(95％CI1.70-44.3)，p=0.008，生育畸形儿母亲组(病例组)G等位基因频率为47％要高于对照组32％，且有统计学意义(P=0.021，OR=1.97，95％CI=1.12-3.44)；生育高畸形儿母亲组和对照组相比基因型频率AG和AA存在显著差异(p=0.009，OR=6.7，95％CI=1.47-30.9)，GG和AA存在显著差异(P=0.005，OR=20.6，95％CI=163.8)。而在生育低畸形儿母亲组没有统计学意义。 研究结论： 1.MTHFRC677T突变尚不能被看作是山西地区汉族人群神经管畸形发病的独立遗传因素； 2.RFC-1 A80G单核苷酸多态性可能与山西地区汉族人群神经管畸形遗传易感性有关。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩略语、图表目录

声明

第一部分Notch在小鼠神经管畸形形成中的作用及分子机制的初步研究

前言

一、Notch在小鼠胚胎发育中的表达及与NTDs的相关性研究

1、Notch在正常小鼠神经胚形成中的表达

2、Notch与ATRA致小鼠NTDs的关系

参考文献

二、Notch信号通路在NTDs形成中的机制研究

1、Notch信号调节的发育相关基因的表达

2、Notch受体被酶切后的NICD蛋白进入细胞核后的变化

参考文献

第三部分 讨论：Notch信号通路RA致小鼠NTDs中的作用机制

参考文献

第二部分MTHFRC677T和RFC-1A80G基因多态性与神经管畸形的相关性研究

前言

1.1实验材料

1.2实验方法

1.3统计学分析

1.4结果

1.5讨论

参考文献

综述

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致谢