活性氮簇在衰老大鼠心肌组织的含量变化及可能的意义

摘要

活性氧簇(Reactive Oxygen Species，ROS)是已知的衰老过程中蛋白修饰和细胞损伤的重要介质。但衰老动物心肌细胞凋亡的增加并不能单一用ROS的产生解释。近年来大量研究资料表明，源于一氧化氮(Nitric Oxide，NO)的活性氮簇(Reactive Nitrogen Species， RNS)也是蛋白修饰和细胞损伤的重要介质。NO由三种一氧化氮合酶(Endothelial Nitric Oxide Synthase，eNOS；Inducible Nitric Oxide Synthase，iNOS；Neuronal Nitric Oxide Synthase， nNOS)催化L-精氨酸生成。 大量研究表明RNS具有抗凋亡和抑凋亡的双重作用，浓度、胞内时空分布、氧化还原状态可能是RNS促进或抑制细胞凋亡的决定因素。生理状态的NO(低浓度的NO)可直接与O<,2>生成NO<,2>，后者再与另-NO反应生成N<,2>O<,3>，N<,2>O<,3>可作为NO<'+>供体，使蛋白质发生S-亚硝基化，后者是NO抗凋亡效应的主要途径；而高浓度的NO(如iNOS催化生成的NO)可以与O<,2><'->反应生成极为活跃的过氧亚硝基(ONOO<'->)，它可以作为NO<,2><'+>的供体导致蛋白质的硝基化，后者是NO致凋亡效应的主要途径。细胞培养研究证明，衰老的内皮细胞中S-亚硝基化蛋白质含量下降，但衰老心脏心肌细胞的S-亚硝基化蛋白质含量是否下降，以及衰老的心肌细胞凋亡增高的原因是否与其RNS的促凋亡和抑凋亡效应失调有关还未确定。 NO不能直接引起蛋白质S-亚硝基化，必需通过NO<'+>供体(N<,2>O<,3>)或NO丢失一个电子产生NO<'+>来参与这一过程。由于N<,2>O<,3>的生成需要2分子的NO，在细胞膜中脂溶性的NO与O<,2>更易聚集而生成NO<'+>供体---N<,2>O<'3>，从而使蛋白质更易发生 S-亚硝基化。由于eNOS是唯一与膜相关的NOS，其含量和活性很可能与蛋白质S-亚硝基化密切相关。有研究资料表明，衰老动物及培养的衰老细胞中eNOS的含量和活性下降，但老年大鼠心肌组织中的eNOS表达变化报道不一；此外，eNOS表达水平是否与S-亚硝基化蛋白质含量相关还不清楚。 方法： (1)分别选取雄性成年(4-6月，n=10)和老年(22-24月，n=16)SD大鼠，设立成年大鼠组与衰老大鼠组，经右侧颈总动脉插管进入左心室，监测心率、左心室压力、左心室压力变化最大速率和心肌收缩指数(Cardiac Index，CI)等心功能指标； (2)分别采用原位末端标记法(Terminal deoxynucleotidyl Transferase-mediated dUTP Nick End Labeling，TUNEL)和caspase-3活性测定法检测心肌组织中细胞凋亡发生情况： (3)采用免疫组化方法检测心肌组织中的S-亚硝基化的蛋白质和内皮型一氧化氮合酶(eNOS)的分布及含量； (4)利用NitroGlo试剂盒(PerkinElmer)检测心肌组织中S-亚硝基化的蛋白质表达水平； (5)用Western-blot法检测心肌组织中eNOS和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的表达； (6)硝基酪氨酸(Nitrotyrosine，NT)是体内生成过氧亚硝基(ONOO<'->)的标志物，用双抗体夹心酶联免疫吸附实验(Enzyme-linked Immunosorbent Assay，ELISA)检测NT的表达。 结论： 1.衰老大鼠心肌细胞凋亡增加、心脏相对质量下降、心功能明显降低； 2.衰老大鼠心肌组织中，具有细胞毒性的ONOO<'->大量生成，而保护心肌细胞的S-亚硝基化的蛋白质含量下降，减弱其对心肌细胞凋亡的抑制作用。因此，衰老大鼠心肌组织中促凋亡和抑凋亡RNS的失衡，有可能通过促进心肌细胞凋亡导致心肌细胞丢失，最终造成心脏收缩和舒张功能的下降。 3.与成年大鼠相比，衰老大鼠心肌组织中iNOS表达明显增高：同时，eNOS表达明显下降。产生RNS的酶NOS，在衰老大鼠心肌组织中的表达失调，很可能是导致其RNS失调的原因之一。 4.上述结果提示，产生RNS的酶的种类、RNS中的有毒产物和RNS的化学修饰等环节在心肌组织衰老过程中起重要作用。如果在临床工作中采取降低iNOS活性、增加eNOS活性、清除ONOO<'->或者补充S-亚硝基化蛋白质等干预措施，可能将有助于减轻心肌组织的老化。

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Introduction

Materials and Methods

Results

Discussion

Conclusion

Limitation of the present study

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