mRNA差异显示技术在皮肤挫伤中的应用

摘要

目的：运用差异显示技术结合银染初步筛选大鼠皮肤挫伤后皮肤、肌肉的基因表达差异，旨在寻找一种或几种与损伤相关的敏感基因，为法医学病理学实践中推断时间提供科学、有效的参考依据。 方法：实验分为正常对照组(n=6)与实验损伤组(n=6)。实验损伤组：用戊巴比妥钠腹腔注射麻醉大鼠，常规手术消毒后，用250克重力锤在150cm高度自由落下，造成右后肢股四头肌处皮肤、肌肉挫伤，于挫伤后4h将大鼠脱颈处死，于挫伤处取皮肤肌肉组织。正常对照组：将大鼠脱颈处死，取相应皮肤肌肉组织。提取对照组与损伤组的总RNA，经质量评价后，无降解的RNA进行反转录.聚合酶链式反应。以4种锚定引物和3种随机引物，共3×4=12种组合的非特异性引物进行扩增，对扩增后的产物进行1.5％的琼脂糖凝胶电泳，初步筛选差异条带。待确定正常组与损伤组有差异条带之后，将扩增产物进行8％的聚丙烯酰胺凝胶电泳，电压400V、时间3h。对聚丙烯酰胺凝胶进行固定、漂洗、染色、显色、终止、漂洗。用无菌刀片切下差异条带，进行2次扩增。经过TIANquick Maxi Purification Kit纯化之后的扩增产物与pMDl8－T Vector连接并转染到JM109感受态细胞中，之后在SOC培养基、LB琼脂平板培养基(Amp+)中进行培养。挑选白色单菌落接种到含有Amp+LB液体培养基过夜培养，送菌液进行测序，测序结果提交GenBank进行对比。 结果：(1)实验组与对照组皮肤肌肉总RNA的质量符合实验要求，其A260/A280值可达1.913。(2)：PCR扩增产物进行1.5％的琼脂糖凝胶电泳后，实验组皮肤与肌肉与对照组比较出现差异条带。(3)PCR扩增产物进行8％的聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染后实验组皮肤与肌肉出现差异条带，差异条带大约在150-600bp之间，总计22条差异条带。(4)2次扩增产物与pMDl8－T Vector连接并转染到JM109感受态细胞中，LB琼脂平板培养基(Amp+)中进行培养。出现白色菌落与蓝色菌落。(5)菌液进行测序，测序结果提交GenBank进行对比，发现5个差异表达片段与GenBank的大鼠肌钙蛋白、核酸结合蛋白、细胞色素c氧化酶、Rattus norvegicus myxovirus(influenza virus)resistance 2、Mouse DNA sequence from clone RP23-403G13有同源性，其余的差异条带没有同源性。 结论：大鼠皮肤损伤过程中有多种基因参与表达。肌钙蛋白与细胞色素c氧化酶在损伤后，它们的mRNA表达均增加，但不清楚对损伤过程是一种保护作用或是损害作用，以及与损伤时间是否存在一定数量关系还有待进一步研究。

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附图

综述 mRNA差异显示技术在损伤时间推断中的应用和展望

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